专利名称：一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。
背景技术：
肺炎链球菌是诱发细菌性肺炎、脑膜炎、胸膜炎、心内膜炎、中耳炎的重要病原菌，是发展中国家儿童细菌性肺炎最常见的病因。全球每年死于肺炎球菌感染者有100-200万。中国肺炎发病率一直很高，近50年来，肺炎球菌感染者中菌血症死亡率一直徘徊在25-29％之间。此外肺炎也是导致60岁以上老人死亡的主要原因之一。由于肺炎链球菌耐药菌株高达96％以上，目前已成为世界性的公共问题。
1983年美国成功研制出23价多糖疫苗，但该疫苗在2岁以下婴幼儿中诱导的保护性低，无免疫记忆反应。以化学方法将蛋白载体共价结合到肺炎链球菌荚膜多糖上，制备成肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗，将多糖由T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原。接种多糖-蛋白结合疫苗后，可使2岁以下婴幼儿产生有效的免疫应答，从而获得免疫保护。初步的临床试验结果表明，肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗在婴幼儿中的安全性和免疫原性良好，诱导产生的抗多糖抗体高于多糖疫苗，并可诱导免疫记忆反应，所以肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的研制具有重要的社会意义和价值。
多糖结合疫苗中的游离多糖含量超过规定的限度会对疫苗临床使用的效果产生不利的影响，因此多糖蛋白结合物中游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，也是反映结合疫苗质量的优劣的主要指标之一。
因为不同细菌荚膜多糖以及不同多糖结合物性质差异较大，所以多糖结合疫苗中的游离多糖测定是一个技术难点，目前尚无多糖结合物中游离多糖含量测定的通用方法。国外文献报道采用高效液相色谱法进行细菌多糖结合物中游离多糖测定，一种采用高效凝胶过滤，一种采用高效阴离子交换色谱。高效凝胶过滤法基于分子大小差异来区分结合多糖与游离多糖，易受到分子大小相近杂质的影响，测定结果误差较大；高效阴离子交换色谱基于分子带电荷性质的差异而区分结合多糖与游离多糖，也易受到与多糖带电荷性质相似的杂质的影响，此外肺炎链球菌多糖在紫外区域没有强的光吸收，无法在配置紫外检测器的高效液相系统上测定肺炎链球菌多糖结合物的游离多糖含量。目前尚无利用乙醇沉淀法、超滤法、蒽酮法测定肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的报道。
发明内容
本发明的方法克服了现有方法无法准确测定肺炎链球菌荚膜多糖结合物游离多糖含量的不足，该方法可以准确、简单地测定肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖的含量。
本发明的技术方案及步骤(1)取待测肺炎链球菌荚膜多糖结合物为样1；待测肺炎链球菌荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3；(2)另取肺炎链球菌荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中；向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70～90小时；于5℃、4500～6500rpm离心60～90分钟，弃上清液；(3)向每离心管加入0.75ml 0～60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入相同乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、4500～6500rpm离心40～60分钟，每离心管单独收集上清液；(4)将结合物上清液用3～100kD超滤杯超滤，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；将对应衍生物上清液用3～100K超滤杯超滤，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4；(5)用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；(6)根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率应在80-120％；(7)根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，式中P为回收率。
其中的肺炎链球菌可以为以下任一种1型、2型、3型、4型、5型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型、33F型；所用的超滤杯截留分子量可以为5～50kD。
本发明的有益效果是利用肺炎链球菌荚膜多糖与肺炎链球菌荚膜多糖结合物在乙醇、强电解质存在条件下结合多糖与游离多糖的不同沉降特性，将游离多糖与结合多糖分离，然后通过超滤杯超滤去除干扰蒽酮法测定的盐和乙醇，然后通过蒽酮法测定各样品的多糖浓度，进而计算出游离多糖的百分含量。本发明提供了一种准确测定肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的方法，从而评价制品质量。
具体实施例方式实施例1取肺炎链球菌1型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌1型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌1型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌1型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70小时；于5℃、4500rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml注射用水(即含乙醇0％)，振荡混合，室温静置1小时；然后加入注射用水2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、4500rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用3kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用3kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝29.37μg/ml，A2＝5.54μg/ml，A3＝36.53μg/ml，A4＝53.03μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为96.78％。
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌1型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为12.99％。
实施例2取肺炎链球菌2型荚膜多糖结合物为样1，取待测肺炎链球菌2型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌2型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌2型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃90小时；于5℃、6500rpm离心90分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、6500rpm离心60分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用100kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用100kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4。A1＝18.54μg/ml，A2＝4.92μg/ml，A3＝27.62μg/ml，A4＝40.82μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.53％。
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌2型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为17.95％。
实施例3取肺炎链球菌3型荚膜多糖结合物为样1，取待测肺炎链球菌3型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌3型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌3型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃90小时；于5℃、5500rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 40％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入40％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5500rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4。A1＝28.35μg/ml，A2＝5.78μg/ml，A3＝26.72μg/ml，A4＝40.21μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为100.32％。
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌3型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为13.55％。
实施例4取肺炎链球菌4型荚膜多糖结合物为样1，取待测肺炎链球菌4型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌4型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌4型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃90小时；于5℃、6500rpm离心90分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、6500rpm离心60分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4。A1＝18.89μg/ml，A2＝5.05μg/ml，A3＝28.62μg/ml，A4＝41.41μg/ml根据公式计算回收率P
P=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为96.46％。
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌4型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为18.48％。
实施例5取肺炎链球菌5型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌5型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌5型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌5型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5500rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5500rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝32.37μg/ml，A2＝7.54μg/ml，A3＝24.53μg/ml，A4＝37.03μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为100.64％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌5型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为15.43％。
实施例6取肺炎链球菌6B型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌6B型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌6B型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌6B型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃85小时；于5℃、5000rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝42.26μg/ml，A2＝11.42μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝38.73μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，计算回收率为97.32％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌6B型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为18.51％。
实施例7取肺炎链球菌7F型荚膜多糖结合物为样1，取待测肺炎链球菌7F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌7F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌7F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃90小时；于5℃、6500rpm离心90分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、6500rpm离心60分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4。A1＝21.89μg/ml，A2＝7.36μg/ml，A3＝28.12μg/ml，A4＝41.25μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为97.80％。
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌7F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为22.92％。
实施例8取肺炎链球菌8型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌8型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌8型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌8型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5500rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5500rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝30.57μg/ml，A2＝6.54μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝39.03μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.08％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌8型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为14.54％。
实施例9
取肺炎链球菌9N型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌9N型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌9N型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌9N型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃85小时；于5℃、5000rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝40.26μg/ml，A2＝9.42μg/ml，A3＝25.53μg/ml，A4＝37.23μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，计算回收率为97.22％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌9N型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为16.04％。
实施例10取肺炎链球菌9V型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌9V型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌9V型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌9V型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5000rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝28.02μg/ml，A2＝2.47μg/ml，A3＝31.20μg/ml，A4＝46.08μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.5％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌9V型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为6.0％。
实施例11取肺炎链球菌10A型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌10A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌10A型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌10A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5500rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5500rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝32.57μg/ml，A2＝7.34μg/ml，A3＝28.53μg/ml，A4＝42.23μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.68％；根据公式计算游离多糖含量H
H=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌10A型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为15.23％。
实施例12取肺炎链球菌11A型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌11A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌11A型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌11A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃85小时；于5℃、5000rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝38.52μg/ml，A2＝6.42μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝38.76μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，计算回收率为97.40％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌11A型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为11.41％。
实施例13取肺炎链球菌12F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌12F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌12F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌12F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5000rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝29.52μg/ml，A2＝5.48μg/ml，A3＝32.20μg/ml，A4＝47.38μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.10％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌12F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为12.62％。
实施例14取肺炎链球菌14型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌14型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌14型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌14型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃75小时；于5℃、5000rpm离心80分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝26.65μg/ml，A2＝5.62μg/ml，A3＝23.61μg/ml，A4＝34.33μg/ml
根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为96.94％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，计算出肺炎链球菌14型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为14.5％。
实施例15取肺炎链球菌15B型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌15B型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌15B型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌15B型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5000rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用50kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝28.52μg/ml，A2＝5.48μg/ml，.A3＝31.20μg/ml，A4＝46.38μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为99.10％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌15B型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为12.93％。
实施例16取肺炎链球菌17F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌17F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌17F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌17F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃75小时；于5℃、5000rpm离心80分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝27.35μg/ml，A2＝6.52μg/ml，A3＝24.61μg/ml，A4＝36.33μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.42％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，计算出肺炎链球菌17F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为16.15％。
实施例17取肺炎链球菌18C型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌18C型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌18C型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌18C型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5000rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用30kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝28.65μg/ml，A2＝4.32μg/ml，A3＝30.42μg/ml，A4＝45.92μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为100.64％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，计算出肺炎链球菌18C型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为9.98％。
实施例18取肺炎链球菌19A型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌19A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌19A型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌19A型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃80小时；于5℃、5500rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝24.85μg/ml，A2＝3.82μg/ml，A3＝32.42μg/ml，A4＝46.82μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为96.28％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，计算出肺炎链球菌19A型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为10.64％。
实施例19取肺炎链球菌19F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌19F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌19F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌19F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70小时；于5℃、5000rpm离心60分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心40分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝31.65μg/ml，A2＝5.12μg/ml，A3＝28.62μg/ml，A4＝40.92μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为95.32％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌19F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为11.31％。
实施例20取肺炎链球菌20型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌20型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌20型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌20型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70小时；于5℃、5000rpm离心80分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 40％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入40％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝19.77μg/ml，A2＝2.54μg/ml，A3＝29.53μg/ml，A4＝41.03μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为92.6％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌20型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为9.2％。
实施例21取肺炎链球菌22F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌22F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌22F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌22F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70小时；于5℃、5000rpm离心80分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝29.57μg/ml，A2＝6.24μg/ml，A3＝28.53μg/ml，A4＝42.03μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.21％；
根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌22F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为14.32％。
实施例22取肺炎链球菌23F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌23F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌23F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌23F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70小时；于5℃、5000rpm离心80分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml注射用水(含乙醇0％)，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入注射用水2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用5kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝31.71μg/ml，A2＝7.27μg/ml，A3＝27.36μg/ml，A4＝38.50μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为93.8％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌23F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为16.3％。
实施例23取肺炎链球菌33F型荚膜多糖结合物为样1；取待测肺炎链球菌33F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3。
另取肺炎链球菌33F型荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌33F型荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中。向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃75小时；于5℃、5000rpm离心70分钟，弃上清液。
向每离心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、5000rpm离心50分钟，每离心管单独收集上清液。
结合物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；对应衍生物上清液用10kD超滤杯用注射用水超滤3次，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4。
用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；A1＝23.45μg/ml，A2＝4.31μg/ml，A3＝26.78μg/ml，A4＝39.69μg/ml根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率为98.8％；根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎链球菌33F型荚膜多糖结合物原液中游离多糖含量为12.4％.
权利要求
1.一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其步骤是(1)取待测肺炎链球菌荚膜多糖结合物为样1；待测肺炎链球菌荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液为样3；(2)另取肺炎链球菌荚膜多糖结合物4.5ml，置于50ml离心管中；取肺炎链球菌荚膜多糖结合物对应的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml离心管中；向每离心管加入5mol/L氯化钠溶液1.125ml，振荡混匀，再加入无水乙醇22.5ml，振荡混匀，置-20℃70～90小时；于5℃、4500～6500rpm离心60～90分钟，弃上清液；(3)向每离心管加入0.75ml 0～60％乙醇溶液，振荡混合，室温静置1小时；然后再加入相同乙醇溶液2.25ml，振荡混合，室温静置2小时；于15℃、4500～6500rpm离心40～60分钟，每离心管单独收集上清液；(4)将结合物上清液用3～100kD超滤杯超滤，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样2；将对应衍生物上清液用3～100K超滤杯超滤，收集超滤后液、超滤杯清洗液，并补加注射用水至3ml即为样4；(5)用蒽酮法测定样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为A1、A2、A3、A4；(6)根据公式计算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率应在80-120％；(7)根据公式计算游离多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，式中P为回收率。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其特征为所述的肺炎链球菌为以下任意一种1型、2型、3型、4型、5型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型、33F型。
3.根据权利要求1所述的一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其特征为所述超滤杯截留分子量为5～50kD。
全文摘要
本发明一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域，其步骤为取肺炎链球菌荚膜多糖结合物为样1，另取等量肺炎链球菌荚膜多糖结合物，加入无水乙醇和氯化钠，置－20℃70～90小时，离心去上清液；用适当溶剂充分洗涤沉淀，离心收集上清液，上清液经超滤脱盐和乙醇后为样2；以蒽酮法测定样1、样2的多糖含量，计算出肺炎链球菌荚膜多糖结合物中的游离多糖含量。本发明可准确、简便地测定出肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖的含量。
文档编号G06F19/00GK1963500SQ20061004887
公开日2007年5月16日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者黄镇, 吴凯 申请人:云南沃森生物技术有限公司