基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分析预测平台的建立方法，尤其是一种基于代谢组学数据建立分 析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病认知功能障碍作为糖尿病的常见并发症，主要症状以学习能力下降、 记忆损害为主，严重可发展为痴呆。虽然并不是糖尿病中最严重的并发症，但由此病引 起的后果是非常严重的，譬如糖尿病患者忘记吃药，将会加重病情等。糖尿病患者患上 认知功能障碍的几率比正常人高50%，II型糖尿病中年患者患痴呆的长期风险显著提 高；65岁以上的老年人12~25%都患有糖尿病，世界范围内10到15个痴呆患者就有1 个是由II型糖尿病引起，如果把糖尿病前期也纳入考虑，大约可达到疒10个患者中就 有1个。目前，临床上采用MoCA和丽SE方法来评价糖尿病认知功能障碍，缺乏血液 学证据。
[0003] 高效液相色谱作为一种分离设备的联用技术被广泛的使用，其中以高效液相色谱 质谱联用最为常见。高效液相色谱-质谱联用技术始于20世纪70年代，其分析的物质多 数直接进样在HPLC上得到分离，然后在MS上获得准确的定性和定量，从而大大地缩短了 分析时间，提高了分析的灵敏度和准确性。
[0004] 但是，迄今为止还没有关于以高效液相色谱-质谱联用技术分析血浆内源性成分 并获得代谢组学数据，从而建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种基于代谢组学数据建 立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。
[0006] 本发明的技术解决方案是：一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能 障碍平台的方法，其特征在于按照如下步骤进行： a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未 患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；将三组血浆样本均置于室温 下解冻15min，涡漩震荡5s ;分别取每个样本100 ill加入300 ill HPLC级甲醇，涡漩震荡 30s，4° C静置20min;对所有样本进行冷冻离心，12000rpm，4° C，15min，取每个样本的上 清液； b. 将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离； 色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱，分离条件为：柱温为40°C ;流速0. 4 ml/min ;流 动相组成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸；梯度洗脱程序见表1 ;进样量为5 yl，自动 进样器温度4°C ; 表1
质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V 型； 正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度KKTC;脱溶剂气温度 350°C、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V;离子扫描时间0.03 s、扫描 时间间隔0.02 s、数据采集范围：5(T100 0 m/z ;应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子 模式下产生[M+H]+离子556. 2771 Da ; c. 数据处理： 对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用 xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱 碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造 成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰 强度； d. 数据分析： 将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11. 〇的Simca-P软 件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析； e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定： 采用PLS-DA模型第一主成分的VIP值，并结合学生氏t检验的p值确定差异性代谢产 物并对其结构进行鉴定； f. 分析预测平台的建立： 选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤： f. 1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排 列，P值升序排列，形成四个列表； f. 2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成 预测平台。
[0007] 本发明是采用高效液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定健康人、糖尿病患者但未 患认知功能障碍及糖尿病患者但患有认知功能障碍三组血浆，利用软件对所分离得到的物 质分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析，确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴 定，选择显著的差异性代谢产物构成分析预测糖尿病认知功能障碍平台。可以及时根据糖 尿病患者的血浆分析预测糖尿病认知功能障碍，及早发现及早治疗，可降低糖尿病认知功 能障碍的发病率，避免糖尿病认知功能障碍进一步恶化及带来的严重后果。
【附图说明】
[0008] 图1是本发明实施例1主成分分析PCA得分图。
[0009] 图2是本发明实施例1采用PLS-DA对AB两组样本分析得分图。
[0010] 图3是本发明实施例1采用PLS-DA对AC两组样本分析得分图。
[0011] 图4是本发明实施例1采用PLS-DA对BC两组样本分析得分图。
【具体实施方式】
[0012] 按照如下步骤进行： a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未 患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；每组取24个样本，将三组血浆 样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s ;分别取每个样本100 ill加入300 ill HPLC级 甲醇，涡漩震荡30s，4° C静置20min ;对所有样本进行冷冻离心，12000rpm，4° C，15min， 取每个样本的上清液； b. 将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离； LC/MS仪器分析平台为Agilent, 1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-Mass Q-TOF/MS。
[0013] 色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mmX2. 1臟，1.811111)，分离 条件为：柱温为40°C ;流速0. 4 ml/min ;流动相组成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸； 梯度洗脱程序见表1 ;进样量为5 yl，自动进样器温度4°C ; 表1
质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气;飞行管检测模式V型； 正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度KKTC;脱溶剂气温度 350°C、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V;离子扫描时间0.03 s、扫描 时间间隔0.02 s、数据采集范围：5(T100 0 m/z ;应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子 模式下产生[M+H]+离子556. 2771 Da ; c. 数据处理： 通过安捷伦工作站MassHunter (Version B 03. 01)对所有原始质谱数据进行预处理 并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程