专利名称：燃料电池的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用生物新陈代谢的燃料电池。
背景技术：
燃料电池主要包括燃料电极、氧化剂电极(或空气电极)和电解质。它的工作原理基于水电解的反作用。就是说，燃料电池接收氢和氧并产生水(H2O)和电。更具体地说，燃料(氢)被提供给燃料电极。在氧化时，氢分成电子和质子(H+)。这些质子移动到空气电极通过空气电解质。质子与提供给它的氧在空气电极反应，从而产生水。
燃料电池将燃料的能量直接转换为电能，因此起到作为高效的电力发生器的功能。它可将化石燃料(如天然气、汽油和煤)的能量在任何时间、任何地点很有效地转化为电能。
持续的努力已经投入到产生大规模电力的燃料电池的研究与开发中。事实上，装在航天飞机上的燃料电池不仅产生电力而且为机组人员提供水。燃料电池已经证明其本身是一种无污染的电力发生器。
新近的值得注目的发展是具有聚合的固体电解质的燃料电池，工作于比较低的温度，从室温到大约90摄氏度。预期会发现这种燃料电池不仅用作为大规模的电力发生器，而且用作为用于汽车的小规模电源和用作为用于个人计算机和移动设备的便携式电源。
不幸的是，尽管上述具有聚合的固体电解质的燃料电池有运行于比较低温度的优点，但它仍然存在要解决的问题。例如，当它在室温附近使用甲醇做燃料运行时，它经历了与CO的催化剂中毒。它需要如铂的昂贵的贵金属催化剂；由于交叉(crossover)，它遭受了能量损失；并且当它使用氢做燃料时遇到了困难。
考虑到前述的问题，提出一种想法注意到生物体内发生的生物新陈代谢是一种高效的能量转化机制，将生物新陈代谢用于燃料电池。如在这里使用的术语“生物新陈代谢”包含呼吸作用、光合作用等。生物新陈代谢的优势在于功率产生效率和在室温的温和条件下进行的优越之处。
呼吸作用是一种由下列步骤组成的机制。首先，营养物质如糖类、脂肪和蛋白质被并入微生物和细胞。它们通过糖分解和TCA循环，涉及几个酶的反应(TCA代表三羧酸(tricarboxylic acid))。在其通过的过程中，它们产生二氧化碳(CO2)并且还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，从而将它们的化学能转换为氧化还原能或电能。NADH的电能被直接转换为在电子转移系统中呈梯度的质子的电能。这一步伴随着氧的还原形成水。这样得到的电能在合成酶的帮助下从ADP形成ATP。而该ATP用于微生物和细胞生长所需要的反应。这样的能量转换发生在胞液和线粒体内。
光合作用是一种由以下步骤组成的机制吸收光能并且通过电子转移系统还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，从而产生电能。结果是水的氧化产生氧。电能被用来为固化碳而吸收CO2并用来合成碳水化合物。
生物新陈代谢包括重要的NADH生成反应，由下面的公式(3)表示。燃料(还原形式)+NAD+燃料(氧化形式)+NADH+H+…(3)(酶作用物) 脱氢酶 (产物)迄今为止，已经知道的脱氢酶有几百种。作为催化剂，它们在高选择性的酶作用物到产物的转化中扮演重要角色。它们的选择性来源于以下事实酶由蛋白质分子组成并且因此具有唯一的三维结构。因此断定，装入生物体的燃料顺序地经历包含几十种脱氢酶的反应直到被氧化为CO2。
将生物新陈代谢用于燃料电池的技术想法已经产生微生物电池，它通过电子介体(mediator)提取微生物产生的电能并将电子转移到电极，因此产生电流。(JP-A No.2000-133297)不幸的是，微生物和细胞不仅具有将化学能转化为电能的功能，而且具有其它对能量转化不必要的功能。因此，上述的系统导致因为不希望的反应而消耗电能，因此降低能量转化效率。
为应付这种情形，基于以下想法的燃料电池被提出来将反应中涉及的酶和电子介体从微生物和细胞隔离开来，并且为它们重新构造适当的环境，使得仅仅希望的反应才发生。
但是，事实上这样的燃料电池由于酶的反应速度慢仅产生很低的电流密度。
本发明被完成以解决在传统技术中涉及的上述问题。本发明的目的是提供一种燃料电池，使用生物新陈代谢而且还产生高的电流密度。
发明内容
本发明指向一种燃料电池，它用多种酶在逐步的反应中分解燃料并且将氧化反应产生的电子转移到电极，在其中发生反应使得U(E1)≤U(E2)，这里U(E1)表示通过它的分解反应产生分解产物-1的酶-1的酶活性，U(E2)表示分解分解产物-1的酶组-2的酶活性的和。
用多种酶逐步分解燃料的复杂的酶的反应要求对酶活性有害的中间产物应该被立即分解。根据本发明，建立每种酶的酶活性使得用于后续阶段的分解的一组酶的酶活性大于用于前面阶段的分解的酶-1的酶活性。该系统获得快速的燃料分解。
在上面定义的燃料电池中，所述酶-1是氧化酶(oxidase)。
在上面定义的燃料电池中，所述酶-1的分解反应是氧化反应，它转移电子到辅酶。
上面定义的燃料电池还具有辅酶氧化酶以产生所述辅酶的氧化剂使得U(Co)≥U(E)，这里在辅酶还原剂的产生中涉及的所述多种酶中，U(Co)表示所述辅酶氧化酶的酶活性，U(E)表示一组酶的酶活性的和。
当没有足够的辅酶氧化酶快速氧化酶辅还原剂时，燃料电池通过所述辅酶氧化酶的酶促反应确定，在燃料电池中，电子由酶-1的氧化反应转移到辅酶。但是，这不是本发明的燃料电池的情形，在本发明中，氧化辅酶的辅酶氧化酶的酶活性U(Co)大于燃料氧化(或者辅酶的还原剂的产生)中涉及的一组酶的酶活性的和U(E)。在这个系统中，辅酶的还原剂被快速氧化，产生的电子通过电子介体被转移到电极。
下面给出使用甲醇作为燃料的燃料电池的更具体的描述。使用甲醇做燃料的燃料电池由燃料电极、空气电极、放在所述燃料电极和所述空气电极之间的质子传导隔膜和转移电子到所述燃料电极的酶溶液组成。所述酶溶液包含(乙)醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)和电子介体。所述(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶和硫辛酰胺脱氢酶具有其酶活性，分别被表示为U(ADH)、U(FalDH)、U(FateDH)和U(DI)。
假定(乙)醇脱氢酶被表示为酶-1。对应于酶-1的酶活性U(E1)的酶活性U(ADH)应该使得U(E1)＝U(ADH)≤U(E2)＝U(FalDH)+U(FateDH)，这里U(E2)＝U(FalDH)+U(FateDH)是分解分解产物(甲醛)的酶(甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶)的酶活性的和。然后，假定甲醛脱氢酶被表示为酶-1。对应于酶-1的酶活性U(E1)的酶活性U(FalDH)应该使得U(E1)＝U(FalDH)≤U(E2)＝U(FateDH)，这里U(E2)＝U(FateDH)是分解分解产物(蚁酸)的酶(甲酸脱氢酶)的酶活性的和。考虑到这些因素，使用甲醇做燃料的燃料电池最好应该满足下面的公式(1)。
0＜U(ADH)≤U(FalDH)≤U(FateDH)… (1)在上述的燃料电池中，辅酶氧化酶是硫辛酰胺脱氢酶并且它的酶活性U(DI)对应于U(Co)，并且(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶在辅酶还原剂的产生中都涉及。因此，燃料电池应该满足下面的公式(2)。
U(ADH)+U(FalDH)+U(FateDH)≤U(DI)… (2)在如上述构造的燃料电池中，在催化从甲醇(作为燃料)到CO2的氧化反应的过程中，(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶总共产生三个NADH分子。此外，硫辛酰胺脱氢酶通过电子介体从这样形成的NADH到燃料电极转移二个电子。在这些步骤中产生的H+通过酶溶液和质子传导隔膜到达空气电极。在空气电极，H+、氧(O2)和外部电路来的电子产生水。
准备酶溶液使得酶按照甲醇被氧化的顺序(或酶以这个顺序(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶)产生其最大酶活性。因此，酶溶液允许平稳地分解甲醇并因此允许快速形成NADH。
同样，准备酶溶液使得硫辛酰胺脱氢酶的酶活性大于(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活性的和。因此，酶溶液允许电子从NADH被快速转移到燃料电极而硫辛酰胺脱氢酶不变得饱和。
上述的本发明的燃料电池，其特征在于，电子从辅酶被转移到电子介体。这种燃料电池，其特征还在于，电子介体是维生素K3。
上面刚刚提到的燃料电池，在它被设计为用甲醇作燃料运行的条件下，由燃料电极、空气电极、放在所述燃料电极和所述空气电极之间的质子传导隔膜和允许电子被转移到所述燃料电极的酶溶液组成。酶溶液包含(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶和电子介体，并且电子介体是维生素K3。
维生素K3具有与氧化辅酶的辅酶氧化酶(如硫辛酰胺脱氢酶)相似的平衡氧化还原电势。它平稳地将电子转移到硫辛酰胺脱氢酶并因此起到用于快速电子转移的电子介体的作用。
如上所述，本发明的燃料电池涉及各种酶，其活性被调整使得分解燃料的反应平稳地进行；和各种辅酶(如NADH)，其活性被调整使得电子被平稳地转移到燃料电池电极。此外，本发明的燃料电池使用维生素K3(它起到与脱氢酶如DI兼容的电子介体的作用)使得电子转移快速发生。因此本发明的燃料电池产生快速的反应并产生高的电流密度。
图1是略述根据本发明的燃料电池中涉及的反应的示意图。
图2是略述在图1所示燃料电极内发生的反应的示意图。
图3是显示酒精(ethanol)被用作燃料时发生的复杂的酶的反应的图。
图4是显示葡萄糖被用作燃料时发生的酶的反应的图。
图5是显示实验1中NADH浓度随时间变化的曲线图。
图6是显示实验2中OCV随时间变化的曲线图。
具体实施例方式
以下，参照附图来更详细说明本发明的燃料电池。
本发明的燃料电池是一种利用生物新陈代谢的燃料电池。如图1所示，它主要包括燃料电极、空气电极、将燃料电极和空气电极相互分离的质子导体和酶溶液，酶溶液包含溶解在其中的酶、辅酶和电子介体。酶溶液被装在燃料电极室内以确保它与燃料电池的接触。不断地提供燃料给燃料电极室内的酶溶液。
在如上述所构造的燃料电池中，酶溶液包含复杂的脱氢酶(包括一种以上的NAD+-依赖型脱氢酶)，它通过几个步骤将燃料(比方说，甲醇)氧化为CO2，同时从辅酶NAD+产生NADH。这样产生的NADH在硫辛酰胺脱氢酶的帮助下通过电子介体将两个电子转移到燃料电极。当电子通过外部电路到达空气电极时，电流产生了。上述过程产生的质子(H+)通过有或没有质子传导隔膜的酶溶液移动到空气电极。空气电极从质子(H+)、外部电路提供的两个电子和氧产生水。
根据本发明，采取适当措施使酶(例如NAD+-依赖型脱氢酶)的酶活性最优化并/或选择最佳的电子介体，因此增大电子转移到燃料电极的速率并且也增大电流密度。下面参照图2给出将电子从酶溶液转移到燃料电极的反应(图1所示)的详细描述。
酶溶液包含下面三种溶解在其中的酶。
●(乙)醇脱氢酶(在下文中缩写为ADH)，它从甲醇生成甲醛和NADH。
●甲醛脱氢酶(在下文中缩写为FalDH)，它从甲醛生成蚁酸和NADH。
●甲酸脱氢酶(在下文中缩写为FateDH)，它从蚁酸生成CO2和NADH。
酶溶液中还包含溶解在其中的NADH脱氢酶或硫辛酰胺脱氢酶(在下文中缩写为DI)，它氧化并分解NADH为NAD+和H+。此外，酶溶液包含溶解在其中的电子介体，它通过DI从NADH接收两个电子并转移它们到燃料电极。此外，酶溶液包含溶解在其中的辅酶NAD+，它是NAD+-依赖型脱氢酶参加反应所必需的。
在燃料分解的过程中，酶溶液中的酶应该展示其满足下面条件的酶活性。假定酶-1表示(乙)醇脱氢酶。那么，对应于酶-1的酶活性U(E1)的U(ADH)应该使得U(E1)＝U(ADH)≤U(E2)＝U(FalDH)+U(FateDH)，这里U(E2)代表分解分解产物(甲醛)的酶(甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶)的酶活性的和。或者假定酶-1表示甲醛脱氢酶。那么，对应于酶-1的酶活性U(E1)的U(FalDH)应该使得U(E1)＝U(FalDH)≤U(E2)＝U(FateDH)，这里U(E2)代表分解分解产物(蚁酸)的酶(甲酸脱氢酶)的酶活性的和。考虑到这一点，消耗甲醇作燃料的燃料电池应该满足以下的方程(1)。
0＜U(ADH)≤U(FalDH)≤U(FateDH) …(1)根据本发明，选择三种最佳的NAD+-依赖型脱氢酶，并且以这样的方式使用它们，使得随着甲醇分解的进行，它们的酶活性顺序增大。这种安排允许甲醇快速分解为CO2而不累积中间产物(例如甲醛和蚁酸)，从而以足够高的速度产生NADH。
此外，根据本发明，这是必要的涉及从NADH到燃料电极转移电子的DI的酶活性应该大于涉及NADH产生的那三种NAD+-依赖型脱氢酶的酶活性的和。这种安排加速电子从这样产生的NADH到燃料电极的移动速度。下面的方程(2)表达了这一点，其中U(DI)表示DI的酶活性。
U(ADH)+U(FalDH)+U(FateDH)≤U(DI)…(2)如果DI的酶活性小于NAD+-依赖型脱氢酶的酶活性的和，DI的酶反应制约反应的整个速度，造成电子缓慢移动和低电流密度。
顺便提及，这里使用的术语U(单位)是一种表示酶活性的指标，它是在某个温度和pH下，每分钟1μmol酶作用物的反应速度。
燃料电池的电压通过控制用于每个电极的电子介体的氧化还原电势来建立。换句话说，如果想要较高的电压，燃料电极应该使用具有更负电势的电子介体，并且空气电极应该使用具有更正电势的电子介体。电子介体的选择应该考虑对酶的亲合力(affinity)、它和电极之间电子交换的速度和约束因素的稳定性(例如光和氧)。
总的来看，希望作用于燃料电极的电子介体应该是维生素K3(2-甲基-1，4-萘醌(naphthoquinone)，在下文中缩写为VK3)。VK3具有-210mV氧化还原电势(在pH为7的溶液中)，它比DI的(在pH为7的溶液中大约为-380mV(对Ag/AgCl))更正一点。DI把黄素单核苷酸(下文中缩写为FMN)作为活性部位。这导致DI和电子介体间足够的电子交换速度，这反过来导致大的电流密度。当与空气电极结合时，产生的燃料电池产生比较大的电压。
如果电子介体是1，4-苯醌(+93mV(对Ag/AgCl))，它具有比VK3更正的电势，它的分子在溶液中的扩散产生显著效果，而电流密度的变化没有预料的那么大。此外，它减小燃料电池的电压。或者，如果电子介体为(蒽醌-2-磺酸(-549mV(对Ag/AgCl))，它具有比VK3更负而比DI更正一点的电势，电流密度降低但燃料电池的电压增大。在这种情况下，如果电极这样构造以供给大的反应面积，增大电流密度到某种程度是可能的。因此，VK3可以被任何具有足够的氧化还原电势的电子介体取代。这样的作用于燃料电极的电子介体的例子包括具有醌骨架的化合物；锇、钌、铁、钴等的金属络合物、如benzylviologen的viologen化合物、具有烟酰胺结构的化合物、具有核黄素结构的化合物和具有核苷结构的化合物。
作用于空气电极的电子介体的例子包括ABTS[2，2’-偶氮双(3-乙基苯并噻吩-6-磺酸盐)]和锇、钌、铁、钴等的金属络合物。
在这一系统中，以下面的方式产生电力。首先，甲醇为燃料提供给酶溶液。然后，酶溶液中的ADH催化甲醇的氧化以形成甲醛。这个反应从甲醇去除两个H+和两个电子并形成NADH(NAD+的还原剂)和H+。
其次，FalDH添加H2O到甲醛并去除两个H+和两个电子形成蚁酸。这个反应产生NADH和H+。
此后，FateDH从蚁酸去除两个H+和两个电子形成CO2作为最终产物。这个反应产生NADH和H+。CO2作为最终产物(通常以气体的形式)被从酶溶液去除。结果，CO2一点都不会改变溶液的pH值，并且酶溶液保持其酶活性。
最后，DI氧化由上述过程形成的NADH并转移电子到电子介体的氧化剂，变电子介体的氧化剂为电子介体的还原剂。在电子介体是VK3的情况下，VK3的氧化剂接受两个电子和两个H+变为VK3的氧化剂。电子介体的还原剂转移电子到燃料电极，并返回电子介体的氧化剂。已被DI氧化的NADH变为NAD+和H+，并且当甲醇被NAD+-依赖型脱氢酶分解时，产生的NAD+被重新使用。结果是两个电子从一个NADH分子转移到燃料电极，而产生直流电。
如上所述，在三种NAD+-依赖型脱氢酶分解一个甲醇分子为CO2的步骤中，总共产生三个NADH分子。在这个阶段，从能量状态不同的拥有H+的燃料提取H+，并且这一过程转换化学能为相同的物质(NADH)。利用NADH拥有的化学能或通过转移NADH拥有的电子到燃料电极导致燃料电池具有高的能量转换速度。
为了电子从NADH到燃料电极的平稳转移，希望酶溶液中对DI的酶活性存在足够的电子介体。
为了上述酶稳定并有效地反应，通过tris缓冲液(tris buffer)和磷酸盐缓冲液，酶溶液最好应该保持在大约pH7。同样，利用自动调温器，酶溶液最好应该保持在大约40℃。考虑到电气化学反应，离子浓度(在下文中缩写为I.S.)最好应该大约0.3。如果它过强或过弱，它反向影响酶活性。上述pH、温度和离子浓度将随不同的酶变化。
上述酶、辅酶和电子介体可以以包含它们的酶溶液的形式被使用。但是，至少它们之一可以如生物传感器领域使用的相同方法固定在电极上或电极附近。可以从活性炭或类似的东西(它具有大的表面积)以三维塞满的形式准备燃料电极，使得它和电子介体有大的反应面积。这对更进一步地增大电流密度是有效的。此外，酶通过和戊二醛交联被密集地固定在电极表面，使得电子被平稳地从酶转移到电极表面附近的电子介体。这有助于增大电流密度。
顺便提及，本发明使用的酶不限于上面所述的，可以使用任何其他的酶。上述ADH、FalDH、FateDH和DI可以是通过突变使之对pH和抑制剂比较稳定的。空气电极的酶也可以是任何已知的，例如漆酶或胆红素氧化酶。
本发明的燃料电池使用的燃料包括，除了甲醇、醇(例如乙醇)、糖类(例如葡萄糖)、脂肪、蛋白质和作为从葡萄糖新陈代谢产生的中间产物的有机酸(例如葡萄糖6-磷酸、果糖6-磷酸、果糖1，6-二磷酸、磷酸丙糖异构酶、1，3-二磷酸甘油酯、3-磷酸甘油酯、2-磷酸甘油酯、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、乙酰基-CoA、柠檬酸、顺式丙烯三羧酸、异柠檬酸、草酰琥珀酸、2-酮戊二酸、琥珀酰-CoA、琥珀酸、反丁烯二酸、L-苹果酸和草酰乙酸)。它们可以单独或相互结合使用。
从上述任何葡萄糖、乙醇和葡萄糖新陈代谢的中间产物选择的燃料可被合并进一个系统，在那里，如果它与一种或多种足够的酶(特别是那些TCA循环涉及的)结合，它象甲醇一样被氧化为CO2，并且该系统运转于最佳条件下。因为其极易操作的特性，葡萄糖特别理想。
应该根据要使用的燃料选择酶。例如，燃料电极使用的酶包括葡萄糖脱氢酶、电子传输系统涉及的一系列酶、ATP合酶和任何葡萄糖新陈代谢涉及的酶(例如己糖激酶、磷酸葡糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛磷酸脱氢酶、磷酸甘油变位酶、磷酸丙酮酸水合酶、丙酮酸激酶、L-乳酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、2-oxoglucolate脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶和丙二酸脱氢酶)。
图3是显示当乙醇被用作燃料时发生的复杂的酶反应的图。在第一阶段，通过乙醇脱氢酶(ADH)的作用乙醇被氧化为乙醛。在第二阶段，通过醛脱氢酶(AlDH)的作用乙醛被氧化为醋酸。在每个阶段，NAD+(氧化剂)被还原并且NADH(还原剂)被形成。通过电子介体的电子转移以如图2所示的与甲醇同样的方式发生。假定U(ADH)和U(AlDH)分别代表ADH和AlDH的酶活性。那么方程0＜U(ADH)≤U(AlDH)成立，U(ADH)对应U(E1)，U(AlDH)对应U(E2)。此外，U(ADH)与U(AlDH)的和小于DI的酶活性U(DI)，如由方程U(ADH)+U(AlDH)≤U(DI)所示。
图4是显示当葡萄糖被用作燃料时发生的复杂的酶反应的图。在氧化的第一阶段，通过葡萄糖脱氢酶(GDH)的作用，β-D-葡萄糖被分解为D-葡糖酸-δ-内酯。然后，D-葡糖酸-δ-内酯被水解为D-葡萄糖酸。在葡萄糖激酶存在的情况下，通过水解三磷酸腺苷(ATP)为二磷酸腺苷(ADP)，D-葡萄糖酸被磷酸化为6-磷酸-D-葡萄糖酸。在氧化的第二阶段，通过磷酸葡糖酸脱氢酶(PhGDH)的作用，6-磷酸-D-葡萄糖酸被氧化为2-酮-6-磷酸-D-葡萄糖酸。在每个氧化反应中，NAD+(氧化剂)被还原并且NADH(还原剂)被生成。通过电子介体的电子转移以如图2所示的与甲醇同样的方式发生。假定U(DGH)和U(PhGDH)分别代表GDH和PhGDH的酶活性。那么方程0＜U(GDH)≤U(PhGDH)成立，U(GDH)对应U(E1)，U(PhGDH)对应U(E2)。此外，U(GDH)与U(PhGDH)的和小于DI的酶活性U(DI)，如由方程U(GDH)+U(PhGDH)≤U(DI)所表示的。
一分子乙醇或葡萄糖产生二分子NADH；但是，增大燃料的能量密度是必要的。为了完成葡萄糖分解为CO2，利用葡萄糖新陈代谢是必要的。由乙醛脱氢酶(AalDH)形成的乙酰基-CoA应该被转移到TCA循环，这是必要的。
利用葡萄糖作燃料的燃料电池可以在葡萄糖新陈代谢的帮助下运行。基于葡萄糖新陈代谢的复杂的酶反应大致分为两类醣酵解(葡萄糖的分解和丙酮酸的形成)和柠檬酸循环。它们是公知的，因此这里省略其描述。
在本发明的燃料电池中，燃料电极可以从碳(玻璃碳)、铂或金等形成，空气电极可以从充满碳的携带如铂的催化剂的氟塑料形成。此外，空气电极可以包含氧化还原酶，如漆酶。质子传导隔膜最好应该是象“Nafion 117”(来自DuPont)这样的，它是从氟塑料形成的。
如上所述，本发明的燃料电池的特征在于随着酶反应逐步进行，酶活性增大，如上面的方程(1)和(2)所指明的。以这种方式的酶反应允许燃料(如甲醇)分解为CO2并允许快速反应生成NADH和H+并分解NADH。被选择作为电子介体的VK3加快电子从NADH到燃料电极的迁移速度。单独或相互结合使用上述技术，基于生物新陈代谢的燃料电池产生从未达到过的高的电流密度。希望的是使用两种技术，使得获得较高的反应速度和较高的电流密度。
本发明的燃料电池利用作为高效的能量转换系统的生物新陈代谢。因此，它尺寸小，重量轻，并且它还在室温下工作稳定。此外，它允许容易的燃料处理。
电池反应使用的酶可以以通常的方式、通过从产生想要的酶的培养(cultured)细胞和微生物提取和净化获得。这有助于降低燃料电池的生产成本。
为了进一步阐明本发明，并不作为限制，给出下面的例子。
例子在下面的例子中进行一系列实验来评估本发明的燃料电池。在这些实验中，酶、辅酶、电子介体和燃料被渐渐地添加(以微升量级)，使得浓度和溶液温度的变化在添加后是可忽略的。
实验1首先，研究NADH形成的速度以揭示NAD+-依赖型脱氢酶最适宜的酶活性。
例1用3m1 0.1M的tris缓冲液(pH 7.0，I.S.＝0.3)、5mM NAD+和1M甲醇制作溶液。当搅动的时候，向溶液中通氩气。溶液与25单位ADH、50单位FalDH和75单位FateDH混合。在溶液中加入NAD+-依赖型脱氢酶后，用光程长度为1cm的紫外-可见的分光光度计测量吸光率随时间的变化。测量使用的波长为340nm，它对NADH是特殊的。从吸光率的变化可以确定产生的NADH浓度。酶溶液的温度保持在40±1℃。
例2重复与例1相同的过程测量NADH的浓度，除了NAD+-依赖型脱氢酶溶液用25单位ADH、100单位FalDH和200单位FateDH制成。
比较例1重复与例1相同的过程测量NADH的浓度，除了NAD+-依赖型脱氢酶溶液只用25单位ADH制成，省略FalDH和FateDH。
比较例2重复与例1相同的过程测量NADH的浓度，除了NAD+-依赖型脱氢酶溶液用25单位ADH和50单位FalDH制成，省略FateDH。
比较例3重复与例1相同的过程测量NADH的浓度，除了NAD+-依赖型脱氢酶溶液只用25单位ADH制成，省略FalDH和FateDH，并且在测量开始7.8小时后溶液与50单位FalDH混合，并且在测量开始9.0小时后溶液与75单位FateDH混合。
比较例4重复与例1相同的过程测量NADH的浓度，除了NAD+-依赖型脱氢酶溶液用25单位ADH、20单位FalDH和15单位FateDH制成。
图5显示了在例1和2及比较例1到4中测量的NADH的浓度随时间的变化。下面的表1显示加入的NAD+-依赖型脱氢酶的量。在比较例3那一列的符号(+)表示酶不在开始时加入而在测量过程中加入。
表1
从图5注意到例1中NADH浓度随时间稳定增大。相比之下，在比较例1和2中，NADH形成的速度缓慢，NAD+-依赖型脱氢酶被限制在一或两种。
酶活性按ADH、FalDH和FateDH的顺序增大，例2中增大的比率大于例1。因此，例2中NADH形成的速度大于例1。
相比之下，在比较例1中，NADH的形成在测量开始7小时后到达最高限，其中NAD+-依赖型脱氢酶溶液只用ADH制成。比较例2中NADH的形成速度大于比较例1；但是，在比较例2中，NADH的形成到达最高限，其中NAD+-依赖型脱氢酶溶液用ADH和FalDH制成。其可能原因是甲醇的不完全分解产物(例如甲醛和蚁酸)在酶溶液中积累，它们改变pH并降低酶活性。顺便提及，虽然在图5中未显示，NADH的浓度在测量开始7.8小时及之前没有显著增加。
在比较例3中，NADH的形成速度如在比较例1中那样缓慢，直到加入FalDH，但在加入FalDH和FateDH后它急剧增大。其可能原因是在测量开始后甲醛暂时残存，但在加入FalDH和FateDH后它被分解为蚁酸和CO2。
在比较例4中，酶溶液包含三种NAD+-依赖型脱氢酶(ADH、FalDH和FateDH)但它们的酶活性是顺序降低的，而不像例1那样。因此，NADH形成速度到达最高限。其可能原因是FalDH和FateDH的酶活性低于ADH的并且中间产物(甲醛和蚁酸)的分解被阻碍，这导致与比较例1和2中相似的现象。
实验1的结果提示当甲醇被分解为CO2时，快速分解降低酶活性的中间产物是必要的。为达到这一目标，有必要按其酶活性以提到的顺序顺序增加的方式，使用三种酶(ADH、FalDH和FateDH)作为NAD+-依赖型脱氢酶。
实验2设计这个实验，以通过测量三电极燃料电池开路电压(OCV)，找到NAD+-依赖型脱氢酶和DI的酶活性的充分比率。三电极燃料电池具有玻璃碳工作电极(直径3mm)、铂线的对电极和Ag/AgCl的参考电极。它保持在40±1℃。
例3例1中准备的酶溶液与VK3和200单位DI混合，OCV以下面的方式测量。
用1ml tris缓冲液(pH 7.0，I.S.＝0.3)、5mM VK3(氧化剂)、5mM NAD+和1M甲醇配置溶液。当搅动的时候，向溶液中通氩气。顺便提及，VK3的浓度(5mM)对DI的酶活性是足够的。然后，溶液与25单位ADH、50单位FalDH、75单位FateDH混合。测量OCV。当OCV的值变得稳定时，溶液与200单位DI混合。从此点开始，连续测量OCV。
例4重复与例3相同的过程测量OCV，除了DI的量变为400单位。
比较例5重复与例3相同的过程测量OCV，除了NAD+-依赖型脱氢酶为25单位ADH，省略FalDH和FateDH。
比较例6重复与例3相同的过程测量OCV，除了NAD+-依赖型脱氢酶为25单位ADH和50单位FalDH，省略FateDH。
比较例7重复与例3相同的过程测量OCV，除了NAD+-依赖型脱氢酶为25单位ADH，省略FalDH和FateDH，这时OCV测量开始，在OCV测量开始经过28.1分钟后加入50单位FalDH，在OCV测量开始经过37.3分钟后加入75单位FateDH。
比较例8重复与例3相同的过程测量OCV，除了DI的量变为100单位。
图6显示了例3和4及比较例5到8中测量的OCV随时间的变化。下面的表2显示了例3和4及比较例5到8中使用的NAD+-依赖型脱氢酶和DI的量(酶活性)。在比较例7那一列的符号(+)表示酶不在开始时加入而在测量过程中加入。
表2
如图6所示，在所有的实验中观察到在OCV测量开始后进行酶反应，从而形成VK3的还原剂并降低OCV。但是，OCV降低的速度随加入的酶的酶活性的大小变化。例如，例3中OCV的下降比在比较例5到8中更快，因为相对NAD+-依赖型脱氢酶形成的NADH，存在充分的DI。在例4中结果是不同的，例4中DI的酶反应被大大增强。就是说，从NADH到VK3的电子转移加速并且OCV迅速降低达到大约-0.21V(对Ag/AgCl)，这是VK3的平衡氧化还原电势。这提示在例3和4中，对产生的NADH的量存在充分的DI。
相比之下，在比较例8中，结果是不同的，DI的酶活性对NADH产生的速度是不足的。就是说，在测量的初始阶段OCV的下降速度足够高，但随时间逐渐地下降。其可能原因是DI的酶反应制约了整个的反应速度，从而增大了NADH的量。
比较例5到7的结果可以解释如下。DI的酶活性足够但NAD+-依赖型脱氢酶的酶活性不足，NADH形成速度制约了整个的反应速度，从而减小了OCV降低速度。在比较例5中，虽然没有在图6中显示，但是OCV在测量开始后28.1分钟及之前没有显著下降。
上述实验2的结果表明形成NADH的NAD+-依赖型脱氢酶的酶活性的和应该大于氧化NADH的DI的酶活性。
实验2使用的燃料电池是为其提供用玻璃碳做的燃料电极(或工作电极)的燃料电池。但是，证实了该燃料电极可以用铂或金电极代替。
实验2使用的燃料电池是三电极类型的。但是，证实了即使这个燃料电池被使铂催化剂作空气电极和Nafion隔膜作质子传导隔膜的燃料电池代替，也产生上述相同结果。
权利要求
1.一种燃料电池，它利用多种酶在逐步的反应中分解燃料并转移氧化反应产生的电子到电极，在其中发生反应使得U(E1)≤U(E2)，这里U(E1)表示通过其分解反应产生分解产物-1的酶-1的酶活性，U(E2)表示分解分解产物-1的酶组-2的酶活性的和。
2.根据权利要求1所述的燃料电池，其中酶-1是氧化酶。
3.根据权利要求1所述的燃料电池，其中利用酶-1的分解反应是氧化反应，它将电子转移到辅酶。
4.根据权利要求3所述的燃料电池，它还具有辅酶氧化酶产生辅酶氧化剂，使得U(Co)≥U(E)，这里在辅酶还原剂的产生中涉及的所述多种酶中，U(Co)表示辅酶氧化酶的酶活性，U(E)表示一组酶的酶活性的和。
5.根据权利要求3所述的燃料电池，其中辅酶给出NAD+的氧化剂和NADH的还原剂。
6.根据权利要求4所述的燃料电池，其中辅酶的氧化剂由作为硫辛酰胺脱氢酶的辅酶氧化酶形成。
7.根据权利要求3所述的燃料电池，其中辅酶将电子进一步转移到电子介体。
8.根据权利要求7所述的燃料电池，其中电子介体是维生素K3。
9.根据权利要求1所述的燃料电池，其中燃料是从下列物质构成的组中选择的至少一种酒精、糖类、脂肪、蛋白质和有机酸。
10.根据权利要求8所述的燃料电池，其中燃料是从下列物质构成的组中选择的至少一种甲醇、乙醇和葡萄糖。
11.根据权利要求1所述的燃料电池，其中燃料是甲醇，逐步地分解燃料的酶是(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶。
12.根据权利要求1所述的燃料电池，其中燃料是乙醇，逐步地分解燃料的酶是(乙)醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。
13.根据权利要求1所述的燃料电池，其中燃料是葡萄糖，逐步地分解燃料的酶是葡萄糖脱氢酶、葡糖酸激酶(gluconokinase)和磷酸葡糖酸(phosphogluconate)脱氢酶。
14.根据权利要求3所述的燃料电池，其中燃料是甲醇，逐步地分解燃料的酶是(乙)醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶，氧化辅酶的辅酶氧化酶是硫辛酰胺脱氢酶，并且由下面的方程(1)和(2)指定的条件被满足0＜U(ADH)≤U(FalDH)≤U(FateDH) ......(1)U(ADH)+U(FalDH)+U(FateDH)≤U(DI)......(2)这里，U(ADH)表示(乙)醇脱氢酶的酶活性，U(FalDH)表示甲醛脱氢酶的酶活性，U(FateDH)表示甲酸脱氢酶的酶活性，U(DI)表示硫辛酰胺脱氢酶的酶活性。
全文摘要
一种使用生物新陈代谢时能够产生高的电流密度的燃料电池。在这种电池中，利用多种酶而燃料逐步地降解，同时转移与氧化有关而生成的电子到电极。在用于降解燃料的酶中，在前一步中实现降解的酶的酶活性不大于在后续步骤中实现氧化的酶的酶活性的和。在辅酶参与的情况下，实现辅酶氧化的氧化酶的酶活性不小于参与还原形式的辅酶的形成的酶的酶活性的和。
文档编号H01M8/16GK1579033SQ0380138
公开日2005年2月9日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月26日
发明者酒井秀树, 富田尚, 高木良介, 铃木佑辅, 畠泽刚信 申请人:索尼株式会社