专利名称：蛋白质光电转换器件、光电转换系统和蛋白质固定化电极的制作方法
技术领域：
本公开涉及蛋白质光电转换器件、光电转换系统、蛋白质光电转换器件的制造方法、光电转换系统的制造方法以及蛋白质固定化电极。更具体地讲，本公开涉及在蛋白质光电转换器件、光电转换系统、蛋白质光电转换器件的制造方法、光电转换系统的制造方法和蛋白质固定化电极中使用具有细胞色素(cytochrome)b562碱基(base)的蛋白质。
背景技术：
期待蛋白质成为替代半导体器件的下一代功能器件。半导体器件仅仅可以小型化到几十纳米，而蛋白质可以在2nm至IOnm的小得多的尺寸下表现出高度精密的、复杂的功倉泛。已经提出了一种使用蛋白质的光电转换器件，具体来说是使用蛋白质固定化电极的光电转换器件，在该蛋白质固定化电极的结构中通过以锌取代马心肌细胞色素 c (horse myocardial cytochrome c)中血红素(heme,亚铁血红素)的中心金属铁获得的锌取代细胞色素c被固定在金电极上。介绍了蛋白质固定化电极能够产生光电流(参见 JP-A-2007-220445)。作为使用蛋白质的光电转换器件的另一个示例，提出一种使用蛋白质固定化电极的器件，在该蛋白质固定化电极的结构中锌取代细胞色素C552被固定在金电极上(参见 JP-A-2010-190646)。有多个关于细胞色素b562的报道，包括使用大肠杆菌的表达和纯化方法(参见 Nikkila，H.，Gennis，R. B. and Sliger，S. G. Eur. J. Biochem. 202，309 (1991))、构象(conformation)(256B. pdb, 参见 Mathews, F. S. , Bethge, P. H. and Czerwinski, E. ff. J. Biol. Chem. 254，1699 (1979))、用于提取血红素的方法(参见 Itagaki，Ε·，Palmer,
G.and Hager, L. P. J. Biol. Chem. 242，2272 (1967))、用于结合锌卟啉的方法(参见 Hamachi, I. , Takashima, H. , Tsukiji, S. Shinkai, S. , Nagamune, T. and Oishi, S. Chem. Lett. 1999，551 (1999))、用于将醌(quinone)结合到分子中的方法(参见Hay, S.， Wallace, B. B., Smith, T. A., Ghiggino, K. P. and Wydrzynski, T. Proc. Natl.Sci USA, 101,17675(2004))以及用于银电极的固定方法(参见 Zuo，P.，Albrecht, T. Baker, P. D.， Murgida, D. H. and Hildebrandt, P. Phys. Chem. Chem. Phys. 11, 7430 (2009))。还提出了一种使用锌取代细胞色素C552的用于蓝光的光电转换器件，以及使用改性的锌卟啉细胞色素C552 的用于红光或绿光的光电转换器件(参见JP-A-2010-190646)。
发明内容
然而，在JP-A-2007-220445中提出的光电转换器件中的锌取代细胞色素c的制备中使用的马心肌细胞色素c中，辅基(prosthetic group) P卜啉被共价结合到半胱胺酸残基。这使得难以从马心肌细胞色素c分离卟啉，并且仅仅可能以锌或锡来置换中心铁。这已经严重地限制了可使用的蛋白质类型。因此，需要使用包括通过使用源自大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞色素b562作为碱基制备的金属取代细胞色素b562的各种蛋白质的蛋白质光电转换器件及其制造方法。还需要使用各种蛋白质(包括通过使用源自大肠杆菌的细胞色素b562作为碱基制备的金属取代细胞色素b562)的光电转换系统及其制造方法。而且，需要蛋白质固定化电极及其制造方法，其中，包括通过使用源自大肠杆菌的细胞色素b562作为碱基制备的金属取代细胞色素b562的各种蛋白质被固定。本发明人进行了大量的研究以解决现有技术的上述问题，并且发现使用源自大肠杆菌的细胞色素b562作为碱基的蛋白质可以有效地用作用于蛋白质光电转换器件的蛋白质。细胞色素b562使得很容易将血红素或卟啉添加或去除，并且可以容易地通过中心金属的置换或卟啉的改性而提供多种颜色。还发现细胞色素b562或使用细胞色素b562作为碱基的蛋白质很容易被固定在金电极上。另一个发现是将具有Π电子的氧化还原活性基团(redox active group)导入到使用细胞色素b562作为碱基的蛋白质的分子中可以放大光电流。基于由本发明人独立地获得的上述发现，通过由本发明人进行的刻苦研究完成了本发明。本公开的实施方式旨在提供一种蛋白质光电转换器件，其包括金电极；和固定在金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩(zinc chlorin)细胞色素b562或它们的衍生物或变体。本公开的另一个实施方式旨在提供一种包括蛋白质光电转换器件的光电转换系统，该器件包括金电极；和固定在金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。本公开的又一实施方式旨在提供一种用于制造蛋白质光电转换器件的方法，该方法包括将金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体固定在金电极上。本公开的再一实施方式旨在提供一种用于制造光电转换系统的方法，该方法包括将金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体固定在金电极上。本公开的再一实施方式旨在提供一种蛋白质固定化电极，其包括金电极；和固定在金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。优选地，金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体、或者细胞色素b562或其衍生物或变体以其含有的卟啉丙酸(porphyrin propionic acid)面向金电极的取向而被固定。根据要求，具有Π电子的氧化还原活性基团被导入到金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。根据需要可使用并选择已知的氧化还原活性基团。优选地，色氨酸或醌被用作氧化还原活性基团。适当地选择金属取代细胞色素b562的金属，以便获得期望的光电转换波长。示例包括锌(Zn)、铍(Be)、锶(Sr)、铌(Nb)、钡(Ba)、镥(Lu)、铪(Hf)、钽(Ta)、镉(Cd)、锑(Sb)、钍(Th)和铅(Pb)。细胞色素b562、金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562的衍生物是骨架 (主链)氨基酸残基或卟啉被化学方法改性的化合物。细胞色素b562、金属取代细胞色素b562 或者锌二氢卟吩细胞色素b562的变体是骨架氨基酸残基的一部分被其他氨基酸残基取代的化合物。光电转换系统典型地包括响应不同波长的光的两种以上的光电转换器件。光电转换器件中的至少一种是蛋白质光电转换器件，其包括金电极和固定在金电极上的金属取代细胞色素b562、锌二氢卟吩细胞色素b562、或者其衍生物或变体。根据诸如光电转换系统的使用目的等因素适当地选择光电转换系统中光电转换器件的数量。光电转换系统是，例如，彩色成像器件或光学传感器。除了其中金属取代细胞色素b562、锌二氢卟吩细胞色素b562或者其衍生物或变体被固定在金电极上的蛋白质固定化电极之外，蛋白质光电转换器件还可包括对电极。对电极设置在蛋白质固定化电极对面，它们之间具有间隙。根据如上配置的本公开的实施方式，可以比在细胞色素c中更加容易地执行源自大肠杆菌的细胞色素b562的血红素或卟啉进出的转移。由此，通过使用细胞色素b562作为碱基，可以容易地制备各种蛋白质，诸如金属取代细胞色素b562和锌二氢卟吩细胞色素b562。而且，通过使用用于蛋白质光电转换器件的金属取代细胞色素b562、锌二氢卟吩细胞色素b562 或者其衍生物或变体，光电转换器件可以吸收各种不同波长的可见光。本公开的实施方式可以实现，例如，使用各种蛋白质(例如从用作碱基的细胞色素b562制备的金属取代细胞色素b562)的蛋白质光电转换器件、以及使用该蛋白质光电转换器件的各种光电转换系统。然后利用这些器件或系统制造的高品质彩色成像器件、光学传感器或光电转换器件可以用于实现高品质的电子装置。
图I是示出根据本公开第一实施方式的蛋白质固定化电极的示意图；图2是示出了纯化的细胞色素b562的吸收光谱的示意图；图3A至3C是示出了细胞色素b562的结构的示意图；图4是示出了经由自组单分子层(self-assembled monolayer)在金电极上如何吸附细胞色素b562的示意图；图5是示出了利用细胞色素b562固定化金滴电极(gold drop electrode)获得的循环伏安图的示意图；图6是示出了锌取代细胞色素b562的吸收光谱的示意图；图7是示出了利用锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得的光电流实时波形的示意图；图8是示出了利用锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得的光电流作用光谱的示意图；图9是示出了利用锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得的电流电压曲线的示意图；图10是示出了锌二氢卟吩的结构的示意图11是示出了锌二氢卟吩细胞色素b562的柱洗脱模式的示意图；图12是示出了锌二氢卟吩细胞色素b562的吸收光谱的示意图；图13是示出了利用锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极获得的光电流作用光谱的示意图；图14是示出了利用锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极、锌二氢卟吩固定化金滴电极和二氢卟吩固定化金滴电极获得的光电流作用光谱的示意图；图15是示出了利用锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极获得的电流电压曲线的示意图；图16是示出了锌取代细胞色素b562I17X/H63N的吸收光谱的示意图；图17是示出了如何经由自组单分子层在金电极上吸附锌取代细胞色素b562I17X/ H63N的示意图；图18是示出了利用锌取代细胞色素b562I17X/H63N固定化金滴电极获得的光电流作用光谱的示意图；图19是示出了利用锌取代细胞色素b562I17X/H63N固定化金滴电极、ZnPP固定化金滴电极和野生型锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得光电流作用光谱的示意图；图20是示出了利用锌取代细胞色素b562I17X/H63N固定化金滴电极、ZnPP固定化金滴电极和野生型锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得光电流实时波形的示意图；图21是示出了利用锌取代细胞色素b562I17X/H63N固定化金滴电极、ZnPP固定化金滴电极和野生型锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得的光电流作用光谱的示意图；图22是示出了利用具有不同的甲基紫精添加量的野生型锌取代细胞色素b562固定化金滴电极获得的电流电压曲线的示意图；图23是示出了利用具有不同的甲基紫精添加量的锌取代细胞色素b562I17W/H63N 固定化金滴电极获得的电流电压曲线的示意图；图24是在光学显微镜下观察的细胞色素b562I17W/H63N晶体的相片；图25是示出了细胞色素b562I17W/H63N晶体的晶胞的示意图；图26是示出了色氨酸17附近细胞色素b562I17W/H63N的结构的示意图；图27是在野生型细胞色素b562和细胞色素b562I17W/H63N之间比较A链的示意图；图28是在野生型细胞色素b562和细胞色素b562I17W/H63N之间比较C链的示意图；图29是示出了野生型细胞色素b562和细胞色素b562I17W/H63N在A链上色氨酸17 附近的结构的示意图；图30是示出了野生型细胞色素b562和细胞色素b562I17W/H63N在C链上色氨酸17 附近的结构的示意图；图31是示出根据本公开第二实施方式的蛋白质光电转换器件的示意图；图32是示出了根据本公开第二实施方式的蛋白质光电转换器件的第一示例性用法的示意图；图33是示出了根据本公开第二实施方式的蛋白质光电转换器件的第二示例性用法的示意图；图34是示出了根据本公开第二实施方式的蛋白质光电转换器件的第三示例性用法的示意图35是示出根据本公开第三实施方式的无液体接触全固体型蛋白质光电转换器件的截面图；图36是放大图35中所示的无液体接触全固体型蛋白质光电转换器件的相关部分的截面图；图37是解释根据本公开第三实施方式的无液体接触全固体型蛋白质光电转换器件的操作的示意图；图38是示出了根据本公开第四实施方式的彩色成像器件的第一示例的示意图；图39是示出了根据本公开第四实施方式的彩色成像器件的第二示例的示意图。
具体实施例方式
行描述。
下面将描述用于实现本公开的模式(下文中称为“实施方式”)。将以下述次序进
1.第一实施方式(蛋白质固定化电极及其制造方法)
2.第二实施方式(蛋白质光电转换器件)
3.第三实施方式(无液体接触全固体型蛋白质光电转换器件)
4.第四实施方式(彩色成像器件)〈L第一实施方式〉[蛋白质固定化电极]图I示出了根据第一实施方式的蛋白质固定化电极。如图I中所示，蛋白质固定化电极包括金电极11和其上固定的蛋白质12。蛋白质12是源自大肠杆菌的细胞色素b562、金属取代细胞色素b562、锌二氢卟吩细胞色素b562或者它们的衍生物或变体。虽然图I中所示的蛋白质12是一个分子，但是可根据需要决定金电极11上固定的蛋白质12的数量。通常，多个蛋白质12被固定作为单分子膜(monomolecuIar film,单分子层)或多分子膜。而且，尽管图I中所示的金电极11具有平坦表面，但是金电极11可具有任意表面形状，例如包括，凹陷表面、凸起表面和不规则表面。不管是什么表面形状，都可以容易地固定蛋白质12。而且，金电极11整体上可具有任意形状，例如包括，平板形状和滴状。优选地，蛋白质12以血红素或卟啉丙酸在金电极11侧的方式而固定。因为蛋白质12的血红素或卟啉丙酸位点具有大的负电荷，所以当金电极11的表面带正电时通过静电吸引力可以在金电极11上吸附蛋白质12。可以使用各种已知方法使金电极11的表面带正电，这可根据需要而进行选择。例如，可以使用以允许正电荷在金电极11出现在最外表面上的方式形成自组单分子层(SAM)的方法。[蛋白质固定化电极的制造方法]例如，通过使金电极11的表面带正电并将金电极11浸溃在溶解了蛋白质12的缓冲液中以在金电极11的表面上吸附蛋白质12，可以制造蛋白质固定化电极。[实施例I]a.源自大肠杆菌的细胞色素b562的表达和纯化方法制备结合了源自大肠杆菌的细胞色素b562的结构基因的质粒(Cyt_b562/PKK223-3)，并转化为大肠杆菌 JM109 株。按照 Nikkila, H.，Gennis, R. B.，and Sliger,
S.G. Eur. J. Biochem. 202，309 (1991)中描述的方法表达和纯化。在37°C的LB-Amp培养基(IOOmL)中培养过夜的预培养液(preculture)被转移到极品肉汤(Terrific broth) 4L(2LX 2)中，并且在37°C培养5至6个小时。在添加O. 2mM IPTG之后，将细胞在25°C进一步培养18个小时。结果，获得红色的细菌(70g)。将细菌冷冻，然后悬浮在含有ImM EDTAUmM PMSF、0. 2mg/mL溶解酶、DTT(适量)和DNase (适量)的 IOmM Tris-HCKpH 8. 0,200mL)中。然后通过超声波粉碎细胞。在离心分离之后将2M磷酸添加到上清液以将pH调整到4. 5，并且通过离心分离析出不需要的蛋白质。所得样本通过CM52阴离子交换柱色谱(柱容积80mL，50mM至150mM KCl线性梯度/50mM磷酸钾(pH4. 55))以及通过S印hadex G50 Finegel过滤色谱(柱容积480mL，50mM Tris-HCl，O. ImM EDTA, pH 8. O)来纯化。结果，获得大约80mg的细胞色素
V)
u562°图2示出了纯化的细胞色素b562的吸收光谱。对浸溃在IOmM磷酸钠(pH 7. O)缓冲液中的纯化的细胞色素b562进行测量。如图2所示,纯化状态的细胞色素b562为氧化形式，在418nm和532nm具有吸收峰。在将少量连二亚硫酸盐添加到缓冲液中获得的还原形式中，证实在426nm、531nm和562nm处具有吸收峰。细胞色素b562具有下面的氨基酸序列。在该氨基酸序列中，血红素的配体蛋氨酸7 和组氨酸102 (下划线部分)、和异亮氨酸17具有重要作用，将在下文中描述。ADLEDNMETL NDNLKVIEKA DNAAQVKDAL TKMRAAALDA QKATPPKLED KSPDSPEMKD FRHGFDILVG QIDDALKLAN EGKVKEAQAA AEQLKTTRNA YHQKYRb.在金滴电极上固定细胞色素b562图3A、3B和3C示出了 1979年通过X射线晶体结构分析确定的细胞色素b562 晶体结构(见 Mathews, F. S. , Bethge, P. H. , and Czerwinski, E. ff. J. Biol. Chem. 254, 1699(1979))。图3A示出了带状模型(ribbon model)，血红素和配体氨基酸以棒状模型 (rod model)显示。图3B示出了如图3A中取向的细胞色素b562的电荷分布。通过虚线圈定的椭圆区域是具有最强负电荷的血红素丙酸暴露表面(在图3C中同样如此)。图3C示出了从图3B所示的状态绕竖直轴旋转180°的细胞色素b562的电荷分布(图3B所示的细胞色素b562的背面)。如图3A、3B和3C所示,细胞色素b562具有4螺旋束(helix bundle) 结构，并且有一个辅基血红素分子。血红素丙酸从分子伸出而被暴露。在图3B的电荷分布中，可以看到强负电荷出现在血红素的丙酸位点处。由此，当使金电极11的表面带正电时， 细胞色素b562可以在血红素的丙酸位点处吸附在金电极11上。图4图示了该状态(仅血红素以棒状模型示出)。在此实施例中，在金电极11上形成在最外表面上具有正电荷的自组单分子层13，并且通过在自组单分子层13的带正电的最外表面和细胞色素b562的带负电的血红素丙酸位点之间作用的静电引力将细胞色素b562吸附在自组单分子层13上。具有2mm直径的金滴电极形成为金电极11。用热浓硫酸(120°C )洗涤金滴电极，以及通过在浓硫酸中的氧化还原循环处理来粗糙化金滴电极的表面(形成更加不规则表面)。在室温下将金滴电极浸入0. ImM 11-氨基i^一硫醇(H2N-C11-SH)/乙醇溶液至少16个小时，以形成H2N-C11-SH膜作为金滴电极的表面上的自组单分子层13。用压缩空气干燥具有H2N-C11-SH膜的金滴电极，并且在50 μ M细胞色素b562/4. 4mM磷酸钾溶液(pH 7. 20) (60 μ L)浸泡之后，在4°C培养一昼夜。图5示出了通过将培养后的金滴电极浸溃在IOmM磷酸钠(pH 7. O)中测量的循环伏安图。电位扫描速度是lV/s。如图5所示，获得吸附循环伏安图。金滴电极表面上的细胞色素b562具有L 7±0· 6pmol/cm2的有效表面积。氧化还原电位是· · 4±llmV vs Ag/ AgCl，并且细胞色素b562和金滴电极之间的电子转移速度常数是90±12S'当在金滴电极的表面上形成的11-氨基十一硫醇中混合0%至10%的羟基十一硫醇时，也获得相同的吸附效果。图5还示出了 11-氨基i^一硫醇和10%羟基十一硫醇的混合物的循环伏安图。[实施例2]a.锌取代细胞色素b562的制备在 Hamachi et al. (Hamachi, I. , Takashima, H. , Tsukiji, S. Shinkai, S., Nagamune, T. and Oishi, S. Chem. Lett. 1999,551(1999))中报告了用于制备锌取代细胞色素b562的方法，因此，根据该刊物中描述的方法制备了锌取代细胞色素b562。首先，将IM盐酸添加到3mL的细胞色素b562水溶液(33 μ Μ)以调整pH至2 3。 然后，将3mL的水冷的2-丁酮添加到细胞色素b562水溶液，并且平缓地搅拌混合物以从细胞色素b562萃取血红素。通过移液去除丁酮层。重复该萃取过程直到丁酮层不带有任何颜色。 然后在重复的血红素萃取过程之后将微量IM Tris-HCKpH 8.0)添加到水溶液，以调整pH 至7 8,并且用超纯水透析该溶液(2LX5次)以获得脱血红素细胞色素(apocytochrome)
V)
u562°在二甲亚砜中溶解锌原卟啉IX(ZnPP)，并且以两等份被添加到脱血红素细胞色素 b562 溶液。使用以 50mM Tris-HCl (pH 8.0)和 O. ImM EDTA 平衡的 Bio-gel PlO 脱盐柱来收集蛋白质懼分(fraction),并且获得纯化的锌取代细胞色素b562 (Zn-Cyt b562)。图6示出了锌取代细胞色素b562的吸收光谱。对浸溃在IOmM磷酸钠(pH 7. 0)缓冲液中的锌取代细胞色素b562进行测量。如图6所示，吸收峰出现在280nm、357nm、429nm、 554nm和593nm处，与Hamachi等报告的位置一致。在429nm波长的吸光率与在554nm波长的吸光率的比(A429/A554)为11.05。b.在金滴电极上固定锌取代细胞色素b562以及光电流测量具有2mm直径的金滴电极形成为金电极11。用热浓硫酸(120°C )洗涤金滴电极，并且通过在硫酸中的氧化还原循环处理来粗糙化金滴电极的表面(形成更不规则表面)。在室温下将金滴电极浸入0. ImM 11-氨基十一硫醇(H2N-C11-SH)/乙醇溶液中至少16个小时，以形成H2N-C11-SH膜作为金滴电极表面上的自组单分子层13。用压缩空气干燥具有H2N-C11-SH膜的金滴电极，并且在50 μ M锌取代细胞色素b562/4. 4mM磷酸钾(pH 7.2)溶液(60 μ L)中浸泡后，在4°C下培养一昼夜。使用Ag/AgCl作为参考电极以及Pt网状(mesh)电极作为对电极，在以氮净化的 IOmM磷酸钠(pH 7.0)中测量光电流。图7示出了在300mV、0mV和"SOOmV的偏压下测量的光电流(光电流实时波形)。 在图7中，用420nm波长的光照射30秒、然后停止照射10秒时相对时间绘制电流值。如图7 所示，在该偏压范围中观察的光电流都是阴极的(cathodic)。图8示出了光电流作用光谱。 如图8所示，峰电流波长是418nm至420nm、550nm和586nm,明显不同于图6所示的锌取代细胞色素b562溶液紫外可见吸收光谱中的吸收最大波长429nm、554nm和593nm。在418nm至420nm波长的光电流与在550nm波长的光电流之比是3. 7，该值远小于图6的吸收光谱中的光电流比11. 05。图9示出了相对电势E绘制的在420纳米波长的光电流值。在图9中， 电流电压曲线上的数字表示数据获取的次序。根据JP-A-2007-220445，对于金电极上固定的锌取代细胞色素c，在WOmVGs Ag/AgCl)附近出现阈值，并且在该电位出现光电流的反转。然而，这在图9中所示的锌取代细胞色素b562中并未看到。而且，与JP-A-2007-220445 中不同，添加亚铁氰化钾不会增强光电流。[实施例3]a.锌二氢卟吩细胞色素b562的制备以与实施例2中相同的方式获得脱血红素细胞色素b562。根据Mennenga, A. , Gartner, ff. , Lubitz, ff. and Gorner, H. Phys. Chem. Chem. Phys. 8,5444(2006)合成锌二氢卟吩(ZnCe6,图 10)。25mM 甘氨酸和 50mM 氯化钠(pHIO ； 下文中称作“缓冲液A”)用作化合物溶解缓冲液。制备IOmM 二氢卟吩e6 (50 μ L)、缓冲液 A (45 μ L)和IOOmM无水醋酸锌(5 μ L)的混合物，并在冰中培养至少30分钟(就ZnCe6而言500nmol)。深绿溶液变为亮绿。然后,将等量的55. 6μ M脱血红素细胞色素b562添加到溶液(脱血红素细胞色素 b562 5. I nmol)，并且将混合物在冰中培养至少30分钟。然后将混合物装填到Econo-Pac IODG 脱盐柱(Biorad)，并且用 pH 7. 2 的 50mMKPi 和 IOOmM KCl 洗脱。pH 7. 2 的 500mM KPi 和IOOmM KCl用作缓冲液。收集IiL部分的馏分，并在280nm、412nm和634nm波长下测量吸光率。图11示出了洗脱模式。如图11中所示，在底部曲线中观察到两个单独的带。色素吸收也出现在第一蛋白质馏分中(4mL至SmL的洗脱体积)。IOmL以上的洗脱体积由色素引起。在锌存在的情况下色素吸收并不出现在蛋白质馏分中。具体来说，对于色素的结合，锌和细胞色素b562之间的配位键很重要。在锌胆绿素b562的制备中也观察到该趋势。图12示出了纯化的锌二氢卟吩细胞色素b562的吸收光谱。对浸溃在IOmM NaPi (pH 7.0)缓冲液中的锌二氢卟吩细胞色素b562进行测量。如图12中所示，吸收峰出现在425nm 和641nm波长处。b.在金滴电极上固定锌二氢P卜吩细胞色素b562和光电流测量具有2mm直径的金电极形成为金电极11。用热浓硫酸(120°C )洗涤金滴电极，并且通过在硫酸中的氧化还原循环处理来粗糙化金滴电极的表面(形成更不规则表面)。金滴电极被浸入O. ImM 11-氨基十一硫醇盐酸盐/乙醇溶液中，并且在室温中培养至少16个小时。然后用乙醇冲洗金滴电极，并通过浸入50 μ M锌二氢卟吩细胞色素b562/4. 4mM KPi (pH 7. 2)溶液(60 μ L)中在4°C中培养一昼夜。除了锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极之外，也制备仅仅将其浸入在锌二氢卟吩(ZnCe6)和二氢卟吩(Ce6)中的金滴电极。使用Ag/AgCl作为参考电极以及Pt网状电极作为对电极，在用氮净化的IOmM磷酸钠(pH 7.0)中测量光电流。图13示出了 200mV至· · 200mV的偏压处的光电流作用光谱。对浸溃在IOmM NaPi (pH 7.0)缓冲液中的锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极进行测量。如图13 所示，在锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极中观察到阴极光电流。除了蓝色带的420nm,在红色带的636nm处也观察到电流响应。这是世界第一例在锌卩卜啉蛋白质光电转换器件中观察到红光响应光电流。图14比较锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极与仅仅固定锌二氢卟吩 (ZnCe6)和仅仅固定二氢卟吩(Ce6)的金滴电极之间的光电流作用光谱。偏压是· · 200mV vs Ag/AgCl。如图14所示，与锌二氢卟吩固定化金滴电极的光谱相比，锌二氢卟吩细胞色素b562固定化金滴电极的光电流作用光谱朝红色偏移(红色偏移)了大约2nm。而且，在 460nm波长附近的膨胀没有出现在锌二氢卟吩固定化金滴电极的光谱中。因此，认为对于锌二氢卟吩细胞色素b562和锌二氢卟吩,色素的周围环境是不同的。对于锌二氢卟吩固定化金滴电极的光电流量大于对于锌二氢B卜吩细胞色素b562固定化金滴电极的光电流量。这被认为是因为金滴电极对锌二氢卟吩的吸附大于对锌二氢卟吩细胞色素b562的吸附。图15是示出了相对电势E绘制的在420nm和636nm的光电流值的图。如图15所示，即使在施加正电压的情况下也观察不到阳极电流。图15所示的电流电压曲线显示出二极管状行为。对于锌二氢卟吩固定化金滴电极和二氢卟吩固定化金滴电极也观察到相同的趋势。在实施例2的锌取代细胞色素b562固定化金滴电极中也观察到该趋势(参见图9)。[实施例4]a.细胞色素b562的色氨酸和半胱氨酸变体的制备使用QuickChange Lightning Site 定向突变试剂盒(Stratagene),将实施例 I 的表达质粒和下面的引物(划线部分为突变位点)用于制备I17W/H63N(从异亮氨酸17变为色氨酸，以及从组氨酸63变为天冬酰胺)变体和I17C/H63N (从异亮氨酸17变为半胱氨酸，以及从组氨酸63变为天冬酰胺)变体质粒。注意H63N突变是为了避免在锌卟啉重构期间锋卩卜啉与组氨酸形成配位键(参见Mennenga, A. , Gartner, ff. , Lubitz, ff. and Gorner,
H.Phys. Chem. Chem. Phys. 8,5444(2006))。除了异亮氨酸17外的氨基酸残基可被变为色氨酸。I17ff_sen :5'-CAATTTAAAAGTGTGGGAAAAAGCGGATAAC-3/
I17ff_an s:5,-CCGCTTTTTCCCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG-3
I17C_sen :5'-CAATTTAAAAGTGTGCGAAAAAGCGGATAAC-3/
I17C_an s:5,-CCGCTTTTTCGCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG-3
H63N_sen :5'-GATTTCCGCAACGGTTTCGACATTCTG-3'
H63N_an s:5,-GTCGAAACCGTTGCGGAAATCTTTC-3’这些质粒可转化为大肠杆菌JM109，并且在实施例I的培养以及表达和纯化步骤之后，制备细胞色素b562_117W/H63N和细胞色素b562_117C/H63N。b.导入醌的脱血红素细胞色素b562变体的制备使用如实施例2中的酸-丁酮法将纯化的细胞色素b562_I17C/H63N脱血红素 (deheme)，并且用超纯水(2LX3 次)、lmM DTT(2LX I 次)、ImM醋酸钠(pH 5.0)以及 IOOmM KC1(2LX1次)透析以制备脱辅基蛋白。然后以5倍摩尔量将对苯醌(BQ)或2，3_ 二甲氧基-5-甲基对苯醌(CoQ)添加到脱辅基蛋白，并在室温下将混合物载50mM磷酸钠(pH 7.0)中培养30分钟。用ImM磷酸钠 (pH 7. O) (1LX2次)和超纯水(1LX I次)透析反应溶液以制备醌改性的产品。BQ和CoQ 产品分别为浅洋红和浅黄。
12
关于该方法，报道了醌结合到游离半胱氨酸残基，如图17的右侧所示(下文中描述)。认为醌结合到半胱氨酸17，在该蛋白质中存在的唯一半胱氨酸。 c.锌取代细胞色素b562_117C/H63N的制备以导入醌的脱辅基蛋白的2. 2至2. 5倍量将锌卟啉(ZnPP)添加到导入醌的脱辅基蛋白，并且使用 Bio-rad EconoPaclO DG 脱盐柱(50mM Tris-HCl (pH 8. O)和 O. ImM EDTA 用作缓冲液)来收集蛋白质馏分。图16示出了锌取代细胞色素b562_I17C/H63N的吸收光谱。在图16的右上方插入的是野生型(WT)的吸收光谱。d.在金滴电极上固定锌取代细胞色素b562变体和光电流测量如同实施例I 一样，使用11-氨基十一硫醇将如上获得的锌取代细胞色素13562_ I17C/H63N固定在金滴电极上。图17是在金电极11 (金滴电极)上形成的自组单分子层 13上吸附的锌取代细胞色素b562_I17C/H63N的示意图。在图17中，以棒状模型示出氨基酸 17 (W，BQ, CoQ)和天冬酰胺63(H63N)。将光照射在锌取代细胞色素b562_I17C/H63N固定化金滴电极上使得电子(e_)朝向分子表面跃出电极，如虚线所指示。图17还示出了色氨酸 (Trp)、连接至半胱酰胺(Cys)的对苯醌(BQ)以及连接至半胱酰胺的2，3-二甲氧基-5-甲基对苯醌(CoQ)的结构。使用Ag/AgCl作为参考电极以及Pt网状电极作为对电极，在用氮净化的IOmM磷酸钠(pH 7.0)中测量光电流。图18示出了固定锌取代细胞色素b562_I17C/H63N(X = CoQ, W，BQ)和野生型锌取代细胞色素b562的金滴电极的光电流作用光谱。偏压是· · 300πιν vs Ag/AgCl。如图18 所示，在生成的阴极电流中I17W、I17CoQ和I17BQ变体的光电流是野生型的光电流的2至 3倍。因此，认为这些变体残基增加了光电流。图19示出了相对电势E绘制的420nm波长下光电流值的图。在图19中，电流电压曲线上的数字表示获取数据的次序。Shih, C. , Museth, A. K. , Abrahamsson, M. , Blanco-Rodriguez, A. M. , Bilio, A. J.D. and 8 others, Science, 320,1760 (2008)报道了通过将色氨酸导入以铼络合物改性的铜蛋白质和天青蛋白(2170. pdb)，铼铜电子转移速度提高了两个数量级。然而，在该公开中，色氨酸被设置在蛋白质分子的表面上。另一方面，实施例4为在世界上第一次报道导入蛋白质分子中的色氨酸提高了光电流。在实验中使用金滴电极获得的50nA至80nA的光电流值相当于大约是 JP-A-2007-220445中进行的实验所获得的光电流值的50至80倍的值。图20示出了在300mV的偏压下(vs Ag/AgCl)，锌取代细胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴电极的测得的光电流(光电流实时波形)，以及仅仅固定野生型锌取代细胞色素 b562和仅仅固定ZnPP的金滴电极的测得的光电流。作为缓冲液，使用IOmM磷酸钠(pH7. O)。 在图20中，在用具有420nm波长的光照射30秒、然后停止照射10秒的方式，相对时间绘制电流值。如图20所示，与生成阴极光电流(虽然小)的锌取代细胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴电极相比，ZnPP固定化金滴电极没有生成任何阴极光电流。图21示出了在OmV(vs Ag/AgCl)偏压下，锌取代细胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴电极的光电流作用光谱，以及仅固定野生型锌取代细胞色素b562或ZnPP的金滴电极的光电流作用光谱。作为缓冲液，使用IOmM磷酸钠(pH 7.0)。如图21中所示，对于单独的 ZnPP和锌取代细胞色素b562_117X/H63N中的内含物，光电流作用光谱是不同的。由此，可以说在图18中观察到的光电流来源于蛋白质。[甲基紫精在通过锌取代细胞色素b562产生光电流中的效果]根据JP-A-2007-220445，将中介物(mediator)氰亚铁酸盐/氰铁酸盐(E0 =360mV vs NHE)添加到锌取代细胞色素c固定化电极增强了光电流。光致辐照 (photoirradiation)激发卩卜啉电子,并且与光致激发关联的分子轨道(4个Gourterman轨道)的两个占用的轨道(卟啉Π轨道和锌-硫Π结合轨道的杂化)中生成空穴。空穴强烈地与位于蛋白质的外壳氨基酸上的分子轨道耦合，并且在色素上生成的空穴移动到蛋白质外壳(溶液侧)。由此，该公开提出了一种模型，其中氰亚铁酸盐/氰铁酸盐填充空穴。然而，在使用锌取代细胞色素b562的一系列实验中添加氰亚铁酸盐/氰铁酸盐对光电流并没有影响。事实上，从锌取代细胞色素b562固定化电极仅仅观察到阴极光电流。而且，根据二极管状行为认为，激发的电子朝分子表面移动。为了对其进行测试，根据 Yasutomi, S. , Morita, T. , Imanishi, Y. and Kimura, S. Science, 304,1944 (2004),通过添加具有激发电子增强效果的甲基紫精(EO = -440mV vs NHE)来测量光电流。图22示出了甲基紫精(MV)在固定野生型锌取代细胞色素b562的金滴电极生成光电流的效果。图23示出了甲基紫精在固定锌取代细胞色素b562_I17W/H63N的金滴电极生成光电流的效果。在图22和23中，水平轴(偏压)和竖直轴(420nm波长下的光电流值) 被反转以帮助了解增加的阴极光电流。如图22和23所示，添加甲基紫精增加了野生型以及色氨酸突变体中的光电流量。由此，锌取代细胞色素b562光电流很可能来源于激发电子的移动，而不是空穴移动。该现象也可以通过锌取代细胞色素b562的全电子计算来解释。[色氨酸突变体细胞色素b562的X射线晶体结构分析]将细胞色素b562_I17W/H63N 溶液(IOmM 醋酸钠，pH 5. O ；30mg/mL)与等量的 O. IM Bis-Tris (pH 6. 5)、以及45%聚(丙二醇)P400 (索引-58 (Index-58))混合，并且使用坐滴蒸汽扩散(sitting drop vapor diffusion)技术和悬滴蒸汽扩散(hanging drop vapor diffusion)技术将混合物在20°C培养两天。结果，获得细胞色素b562_I17W/H63N晶体，如图24所示。图24中箭头之间的长度是O. 1mm。晶体是空间群Pl的孪晶，并且以2.53 A分辨率获得衍射数据。统计值在表I中示出。表I :_Cyt b562 I17W/H63N
数据汇集_
空间群 a, b, c (A) α，β, γ(°)
孪晶分数(Twin fractions )
分辨率(A)
冗余
完整性(％)
Rmerge (%)
Ι/σΙ_分辨率(A)20.0-2.53
反射数21,554
R/Rfree25.8/29.2
原子数
蛋白质5061
异质(Hetero)258
水28 平均β因子
蛋白质29.3
异质26.8
水27.3 均方根偏差
键长(A)0.010
键角_1.139括号内的数字是高分辨率单元(cell)的统计值仅使用野生型细胞色素b562 (256B.pdb)的结构中的链A(血红色素除外的异质分子(heteiOmolecule，非主要分子)，二聚物中的链B的删除的坐标数据)作为模板，用程序 Molrep/CCP4来实现分子置换。如图25所示，细胞色素b562_I17W/H63N结晶的每个晶胞包含六个分子。图26是细胞色素b562_I17W/H63N中色氨酸17附近结构的立体图，示出了晶胞的所有六个分子彼此重叠。色氨酸17(Trpl7)侧链的取向对于所有分子是相同的。程序Refmac5/CCP4 用于刚体(Rigidbody)—限制(Restrained) — TLS 精修(TLS refinement)(全部使用基于振幅的孪晶精修(amplitude based twin refinement)),并且用Coot构建手动模型。结合I17W和H63N突变体。详细的统计值在表I中示出。图27是比较细胞色素b562_I17W/H63N和野生型细胞色素b562之间A链(晶胞的六个分子之一)的示图。图28是比较细胞色素b562_I17W/H63N和野生型细胞色素b562之间C 链(晶胞的六个分子之一)的示图。在图27和28中，以棒状模型示出血红素和色氨酸17。 如图27和28所示，细胞色素b562_I17W/H63N的全部结构保持了野生型细胞色素b562的4螺旋束结构。在图27和28中，色氨酸17对面的螺旋IV被朝向分子的外侧(虚箭头)推开。 在野生型细胞色素b562和细胞色素b562_I17W/H63N之间，氨基酸α碳的r.m. s(均方根)偏
权利要求
1.一种蛋白质光电转换器件，包括金电极；和固定在所述金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
2.根据权利要求I所述的蛋白质光电转换器件，其中，所述金属取代细胞色素b562或所述锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体以其包含的卟啉丙酸面向所述金电极的取向而被固定。
3.根据权利要求2所述的蛋白质光电转换器件，其中，具有Π电子的氧化还原活性基团被导入到所述金属取代细胞色素b562或所述锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
4.根据权利要求3所述的蛋白质光电转换器件，其中，所述氧化还原活性基团是色氨酸或醌。
5.根据权利要求4所述的蛋白质光电转换器件，其中，所述金属取代细胞色素b562是锌取代细胞色素b562。
6.根据权利要求I所述的蛋白质光电转换器件，其中，所述金属取代细胞色素b562的金属选自锌(Zn)、铍(Be)、锶(Sr)、铌(Nb)、钡(Ba)、镥(Lu)、铪(Hf)、钽(Ta)Jg (Cd)、锑 (Sb)、钍(Th)和铅(Pb)。
7.一种光电转换系统，包括蛋白质光电转换器件，所述器件包括金电极；和固定在所述金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
8.根据权利要求7所述的光电转换系统，其中，所述金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体以其包含的卟啉丙酸面向所述金电极的取向而被固定。
9.根据权利要求8所述的光电转换系统，其中，具有Π电子的氧化还原活性基团被导入到所述金属取代细胞色素b562或所述锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
10.根据权利要求9所述的光电转换系统，其中，所述氧化还原活性基团是色氨酸或醌。
11.根据权利要求10所述的光电转换系统，其中，所述金属取代细胞色素b562是锌取代细胞色素b562。
12.一种用于制造蛋白质光电转换器件的方法，所述方法包括将金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体固定在金电极上。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体以其包含的卟啉丙酸面向所述金电极的取向而被固定。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，具有Π电子的氧化还原活性基团被导入到所述金属取代细胞色素b562或所述锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述氧化还原活性基团是色氨酸或醌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述金属取代细胞色素b562是锌取代细胞色素V)u562°
17.—种用于制造光电转换系统的方法,所述方法包括将金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体固定在金电极上。
18.—种蛋白质固定化电极,包括金电极；和固定在所述金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或它们的衍生物或变体。
全文摘要
本发明涉及蛋白质光电转换器件、光电转换系统和蛋白质固定化电极。该蛋白质光电转换器件包括金电极；和固定在该金电极上的金属取代细胞色素b562或锌二氢卟吩细胞色素b562或其衍生物或变体。
文档编号H01G9/20GK102593361SQ20121000222
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月5日 优先权日2011年1月13日
发明者中丸启, 后藤义夫, 山田齐尔, 户木田裕一, 罗玮 申请人:索尼公司