专利名称：心房颤动致病基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学、细胞生物学和心脏病学领域。具体地说，本发明涉及心房颤动致病基因YQXM及其编码蛋白。此外，本发明还涉及YQXM核苷酸序列和编码蛋白的制备方法和用途。
背景技术：
根据世界卫生组织的定义，心房颤动(atrial fibrillation)是心房不规则的、杂乱无章的电活动，心电图上P波消失，代之以基线上形状、大小、方向和时程不一的颤动波，在没有高度或完全性房室传导阻滞情况下心室率完全不等。
心房颤动是临床上最常见的心律失常之一，它促发心力衰竭或血流动力学障碍，诱发室速或室颤等致命性心律失常，导致血栓和栓塞事件，增加基础心脏病的死亡率，心房颤动本身还可以引起心脏扩大。
根据统计，美国心房颤动发生率为0.9％。随着年龄的增长，心房颤动发生率激剧增高，在65岁以上者则高达5.9％。根据Framinham研究，老年人(＞65岁)卒中1/3由心房颤动引起。欧洲心房颤动发生率与美国相仿，亚洲略低。心房颤动严重地危害着人类的健康，也给社会带来了相当的经济负担。
1904年Mackenzie较详细地描述了心房颤动，从此以后将近一个世纪已经过去了，然而心房颤动的发生机制依然莫衷一是，心房颤动依旧是医学所面临的一大挑战。
作为心房颤动的特殊类型，特发性心房颤动指无明确的心脏病变基础的心房颤动。其命名比较混乱，其他的名称有孤立性特发性心房颤动、良性特发性心房颤动和家族性特发性心房颤动。多达三分之一的心房颤动归类为特发性心房颤动(Lip GYH，Beevers DG(1995)ABC of atrial fibrillationhistory，epidemiology，and importance of atrial fibrillation.BMJ 3111361-1363)。
KCNE2是一种已知的基因(Genbank登录号No.NM_172201)。KCNE2的其它名称有LQT6和MIRP1。KCNE2基因位于人类21号染色体21q22.12。目前已知KCNE2有1种转录产物。该基因表达产物是快速激活的延迟整流钾通道Ikr的β亚单位。已有的研究表明KCNE2本身突变因其减少Ikr电流可导致恶性心律失常和先天性长QT综合征(LQT6)，后者还可以引起严重心律失常和猝死。然而，没有公开或暗示过KCNE2与人类心房颤动有关。
在本申请之前，公开或报道与人类心房颤动有关的人类心房颤动致病基因只有KCNQ1。
因此，为了有效诊断和治疗心房颤动，本领域迫切需要寻找所有与心房颤动有关的致病基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人类心房颤动致病基因-YQXM及其编码的蛋白，以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的人YQXM蛋白多肽，它选自下组具有27位氨基酸R→C突变的KCNE2蛋白，具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列RIFITYMDNWCQNTTAEQE的保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码上述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；更佳地，该多核苷酸具有选自下组的序列(1)编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(2)SEQ ID NO1中1-809位的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO1中141-512位的核苷酸序列；在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备YQXM多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出YQXM多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的YQXM蛋白多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种组合物，它含有0.001-99wt％的本发明的YQXM蛋白多肽以及可接受的载体。还提供了野生型KCNJ2蛋白或基因的用途，它们被用于制备治疗心房颤动的药物。
在本发明的第七方面，提供了一种检测心脏细胞是否存在心房颤动易感性的方法，它包括步骤检测心脏细胞样品中YQXM转录本与野生型KCNE2转录本相比是否有变化，有变化就表示存在心房颤动易感性；或者检测心脏细胞样品中YQXM蛋白的活性与野生型KCNE2蛋白活性相比是否有变化，有变化就表示存在心房颤动易感性；或者检测基因组样品中YQXM组序列与正常的KCNE2基因组序列的相比是否有变化，有变化就表示该心脏细胞存在心房颤动易感性(即该测试个体患心房颤动的概率高于正常人群)。
较佳地，所述的变化是外显子中的核苷酸的缺失、插入、和置换突变。更佳地，所述的变化选自下组SEQ ID NO1中核苷酸219由C→T，或SEQ ID NO2中27位氨基酸由R→C。
还提供了一种体外检测样品是否存在KCNE2的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用KCNE2基因特异性引物扩增样品的KCNE2基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性219位C→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1或Genbank登录号No.NM_172201。
更佳地，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在本发明的第八方面，提供了一种检测心房颤动的试剂盒，它包括(1)特异性扩增人YQXM的引物对，(2)检测扩增产物与野生型KCNE2相比是否存在变化所需的试剂。还提供了作为引物或探针的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-800个核苷酸。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人YQXM蛋白多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人YQXM蛋白多肽活性的拮抗剂，或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人YQXM蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应。
在本发明的第十方面，提供了含有人YQXM的模型动物。较佳地，所述的模型动物选自小鼠、大鼠。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了野生型的KCNE2和具有219位C→T突变的突变型KCNE2(即YQXM)的核苷酸序列的测序结果，其中，突变位点用箭头标出，该核苷酸突变对应于氨基酸序列中第27位R→C突变。
图2显示了两个在KCNE2中具有219位C→T突变的家系情况，该核苷酸突变对应于氨基酸序列中第27位R→C突变。其中，正方形表示男性，圆圈表示女性；带斜线为死亡，实心的为发现有房颤，空心的未有房颤；箭头表示的为先证者。
具体实施例方式
研究提示，家族性心房颤动的发生机制与可能离子通道有关，本发明人选用八个钾离子通道候选基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)，对28个家族性房颤家系行候选基因突变筛查，在两家系中初步明确了YQXM突变与心房颤动的关系后，排除必须数量以上无亲缘关系的正常随机个体存在同样的基因突变，用膜片钳进行突变功能分析，最终确立该YQXM基因是导致人类心房颤动的致病基因之一。
本发明中YQXM的特征是，它具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，与人类KCNE2基因序列不同之处为YQXM219位(SEQ ID NO1)核苷酸为T，而KCNE2基因219位核苷酸为C。
由于在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中219位核苷酸发生了C→T置换(图1)，因此，本发明YQXM编码具有SEQ ID NO.2所示蛋白序列。与人类KCNE2基因编码的蛋白序列不同之处为，YQXM的第27位氨基酸(SEQ ID NO2)为半胱氨酸(Cysteine，C)，而KCNE2的第27位氨基酸为精氨酸(Arginine，R)。
在本发明中，术语“YQXM蛋白”、“YQXM多肽”或“YQXM编码蛋白”可互换使用，都指具有人YQXM编码蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。该术语还包括含有或不含起始甲硫氨酸的YQXM编码YQXM蛋白。
与野生型KCNE2相比，YQXM基因就是核苷酸序列中第219位发生C→T突变的突变型KCNE2基因，而YQXM多肽就是氨基酸序列中第27位发生R→C突变的突变型KCNE2多肽。
野生型KCNE2的基因组序列列于NT_011512[gi37558541]，其CDS位于21403174-21403545，YQXM的突变位置是21403252位C→T。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的YQXM蛋白或多肽”是指YQXM多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化YQXM蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。YQXM多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人YQXM蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人YQXM蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人YQXM多肽”指具有人YQXM蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人YQXM蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人YQXM DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人YQXM多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
发明还提供人YQXM蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人YQXM多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。
修饰形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人YQXM蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码YQXM蛋白的多聚核苷酸。
本发明的人YQXM核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或YQXM蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的YQXM多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人YQXM多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人YQXM多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人YQXM编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人YQXM蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗YQXM蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗YQXM蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人YQXM蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人YQXM蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人YQXM DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人YQXM产物或片段。较佳地，指那些能与人YQXM产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。一种特别优选的抗体是识别YQXM蛋白但不识别KCNE2蛋白的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人YQXM蛋白的分子，也包括那些并不影响人YQXM蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人YQXM产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人YQXM产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人YQXM蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用人YQXM产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人YQXM产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的YQXM编码蛋白抗体可以用来鉴定表达YQXM编码蛋白的细胞，如心肌细胞。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记YQXM编码蛋白特异抗体，然后让YQXM编码蛋白特异抗体与细胞样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与YQXM编码蛋白特异抗体结合的细胞。
除了在细胞表面检测YQXM编码蛋白外，还可以用Western印迹技术分析该蛋白质。细胞裂解液可以从培养细胞或取自病人的组织标本如心肌中提取，并溶解在含有去污剂的裂解缓冲液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物(同时将提纯的YQXM编码蛋白多肽作为阳性对照)，接着通过电泳杂交将其转移到硝酸纤维素上。为了用Western印迹免疫探测YQXM编码蛋白，可以使用典型的抗体结合检测方法，例如放射自显影或碱性磷酸酶检测方法。并可使用免疫接种血清或不相关的单克隆抗体作为非特异反应的对照。
还可用Nothern印迹法技术分析YQXM编码蛋白的表达，即分析YQXM编码蛋白RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
YQXM编码蛋白DNA的Nothern印迹分析和YQXM编码蛋白特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实YQXM编码蛋白在生物样本中的表达。YQXM编码蛋白DNA还可以用于Southern印迹分析或原位杂交分析，以将该基因定位于染色体上，并可进行遗传连锁分析以找出其它可能的疾病相关基因。
随着人类心房颤动分子遗传机制的部分确立，人类心房颤动基因诊断已经可能在特定人群开展。基因诊断方法包括测序技术、DNA芯片技术等。目前的测序技术和DNA芯片都可方便地检测出某一核苷酸序列中单个或多个核苷酸的变化。一种优选的检测方法是检测YQXM(包括cDNA序列和基因组序列)中编码区是否存在核苷酸变化，例如SEQ ID NO1中219位核苷酸是否由C→T。
随着YQXM的发现，已经可以采用转基因技术在细胞中表达相应蛋白，进而通过膜片钳或电压钳技术研究心房颤动电生理。也可以通过同源重组方法和胚胎干细胞途径或基因显微注射法，建立遗传性心房颤动动物模型，然后通过多导生理记录仪等研究心房颤动电生理。该电生理基础可能正是非应用遗传决定的心房颤动发病的电生理机制或环节之一。
通过电生理技术在转基因细胞模型和转动物细胞模型上可以直接筛选心房颤动新药先导化合物。
通过计算机可以推断编码蛋白空间结构，为心房颤动新药模拟设计提供基础。
遗传决定的人类心房颤动发病机制的阐明有望从新的视角(离子通道)研究其它类型人类心房颤动，促成所有类型人类心房颤动的研究取得突破性进展。
遗传决定的人类心房颤动的新药的发掘和优化可能促成所有类型人类心房颤动的研究取得突破性进展。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与YQXM蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的野生型KCNE2多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的野生型KCNE2施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
基于本发明，来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将野生型KCNE2转移至细胞内。构建携带野生型KCNE2的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外KCNE2可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与人YQXM蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人YQXM蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人YQXM蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人YQXM蛋白水平，可以用作解释人YQXM蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断YQXM蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在YQXM蛋白的方法是利用YQXM蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与YQXM蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在YQXM蛋白。
YQXM蛋白的多聚核苷酸可用于YQXM蛋白相关疾病(如心房颤动)的诊断和治疗。一种方法是检测YQXM的突变，以诊断心房颤动疾病或心房颤动易感性。YQXM蛋白突变的形式包括与野生型KCNE2 DNA序列相比的其他点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等，尤其是位于外显子中突变形式。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。此外，本发明多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因诊断。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1YQXM的识别在本实施例中采用的识别YQXM的策略为(1)研究表明，家族性心房颤动的发生机制可能与离子通道有关；(2)本发明人在28个家族性房颤家系中对八个钾离子通道候选基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)的外显子测序筛查，寻找可能致病的基因突变；(3)在两个家系中初步明确YQXM突变与心房颤动的关系后，进一步排除必须数量以上正常随机个体存在同样的基因突变的可能性；(4)用膜片钳行突变体功能分析，最终确立该YQXM或编码蛋白质导致人类心房颤动。
在本实施例中，按照上述策略确定识别YQXM的步骤为(1)确定候选基因；(2)候选基因的测序筛查；(3)排除必须数量以上正常随机个体存在同样的基因突变的可能性；(4)用膜片钳行突变体功能分析，最终确立该YQXM或编码蛋白质导致人类心房颤动。具体过程如下
根据已有的研究，在本实施例中，分析了一种快速激活的延迟整流钾通道Ikr(β亚单位)基因-KCNE2的外显子。根据KCNE2基因序列，应用Primer3软件设计多对扩增外显子的引物并合成。其中，可扩增出YQXM突变位置的引物序列如表1所示表1 引物序列
采用常规的Touchdown方法做PCR，PCR反应体系主要含有如下成分
反应的总体积为25ul，用ddH2O来补足体积。
将加好样的薄壁PCR管放入PTC-220热循环仪上进行PCR反应。PCR反应条件预变性95℃15min，随后变性94℃30s，退火64℃45s，延伸72℃1min，共35个循环，最后延伸72℃8min。取PCR产物，在含0.5μg/μl溴乙锭的1％琼脂糖凝胶中电泳，证实扩增效果。PCR扩增的目的片段经电泳鉴定和纯化后，用DYEnamicTMET dye terminator kit(Amershan Biosciences)进行双向测序反应。测序反应条件95℃变性20s，50℃退火15s，60℃延伸1min，25个循环。产物经醋酸胺、乙醇沉淀纯化后，在MegaBACE500自动测序仪进行核苷酸序列测定。通过Sequence analyzer软件和肉眼对测序结果进行分析，综合正反双向序列结果识别突变。
经过测序结果和“基因型-表现型”分析，初步证实KCNE2基因存在致病突变，并且KCNE2第219位的突变与心房颤动特别相关(图1，箭头处为KCNE2基因突变点)。之后，在1204例无血缘关系的健康对照中未发现KCNE2的219位C→T突变。功能研究显示KCNE2的R27C突变导致KCNQ1-KCNE2独特的“功能获得”性改变，最终确定YQXM基因或其编码蛋白质可导致人类心房颤动。
YQXM基因具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中开放阅读框位于141-512，其编码蛋白具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
与正常的野生型KCNE2基因(Genbank登录号No.NM 172201)和编码蛋白相比，YQXM基因和蛋白存在以下变化SEQ ID NO1中核苷酸219由C→T，SEQ ID NO2中27位氨基酸由R→C。
讨论图2显示了2个具有YQXM的家系的情况。
这些家系的临床特点如下所示表1 心房颤动家系情况(+为死亡年龄，为目前年龄)
此外，并非所有的KCNE2 R27C突变者都表现出房颤(如家系1中的II-1，II-5，II-6和家系2中II-3，II-6)，解释原因如下(1)、阵发性房颤偶然发生，持续时间短，这样，虽有房颤发生，但是不一定能记录到；(2)、延迟外现。房颤多发生于年老年人。某些突变携带者还未到发病年龄；(3)、KCNE2R27C突变外显不全；(4)、KCNE2R27C突变仅为房颤的易患因素，环境因素在房颤的发生中具有一定的作用。
在对包括KCNE2 R27C在内的多个KCNE2的突变型进行的功能研究发现长LQ综合征(LQT)相关的KCNE2突变-KCNE2T8A、KCNE2Q9E和KCNQ1在COS-7细胞中共表达时，和KCNE2R27C相比，明显抑制KCNQ1-KCNE2电流，而不是增大其电流，当本发明人将KCNE2R27C和HCN1、HCN2和HCN4共表达时，并未改变KCNE2-KCN家族的电流。相对于所有LQT相关的KCNE2突变(Q9E和T8A)，KCNE2R27C突变导致独特的KCNQ1-KCNE2“功能获得”性效应。此外，该突变未影响与LQT发生相关的HERG-KCNE2电流。
实施例2遗传性心房颤动动物模型的建立采用人的KCNE2 cDNA探针扫描129Sv小鼠基因组文库，克隆小鼠基因组KCNE2基因。经PCR、酶切图谱分析和鸟枪法测序证实后，挑选位于小鼠KCNE2上下游的片段，与含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列以及新霉素抗性基因和TK基因联接后，特异性地同源重组于小鼠KCNE2基因位点。使转染的ES细胞能够进行双重药物选择(G418和Gancyclvir)，使筛选同源重组的ES细胞克隆的范围缩小。所获得的ES细胞克隆经PCR和Southern印迹分析证实其正确的同源重组，并经核型分析后注射到C57BL/6品系小鼠的胚泡(blastocysts)内，再将注射的胚泡植入受体小鼠子宫内。筛选出新生小鼠的嵌合体(chimera)，则将其与正常小鼠交配，以获得经生殖细胞遗传的杂合体。杂合体的互相交配，获得YQXM导入(knock-in)的纯合体动物。
YQXM导入的嵌合体、杂合体和纯合体动物与正常同系小鼠相比，在电生理方面、整体动物水平、细胞水平和分子水平上出现的任何差异，一经证实，可视为基因导入的表型，具体研究方法将视动物表型的不同而采取适当的方法加以研究。总而言之，研究方法主要有两个方面，一是YQXM导入小鼠的产生；二是动物表型的分析。
实施例3YQXM编码蛋白的制备和提纯在该实施例中，将全长的YQXM序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达，并提纯重组蛋白。
(1)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据YQXM编码蛋白全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5′和3′端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。用实施例1中获得的YQXM扩增产物为模板，经PCR扩增后，将YQXM在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-YQXM表达载体的工程菌DH5α-pGEX-2T-YQXM。
(2)表达GST-YQXM重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-YQXM工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-YQXM融合蛋白的工程菌。
(3)GST-YQXM融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达GST-YQXM融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-YQXM。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-YQXM的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果，获得的重组YQXM融合蛋白的分子量与预计分子量相符。
实施例4YQXM编码蛋白或多肽在昆虫细胞中进行真核细胞表达
(1)YQXM杆状病毒表达载体的构建及转染Sf9昆虫细胞株根据YQXM的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，从而构建表达载体。将YQXM cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pVL1392载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，野生型线性杆状病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的昆虫培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×106)Sf9昆虫细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。
(2)转入重组表达载体的昆虫细胞株的筛选鉴定转染3天后的昆虫细胞用新鲜培养基制成细胞悬液(2×106/1ml)，取1ml细胞悬液置于60mm组织培养皿中，加入3ml培养基，100μl收集的培养上清，贴壁1小时，弃2ml培养基，继续室温培养1小时，弃去所有的培养基，加入预热的含20μl 4％ X-gal的3ml半固体培养基，培养5-7天后挑取白色细胞克隆于96孔培养板中培养3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆虫细胞。
收集感染的细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗YQXM编码蛋白的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗YQXM编码蛋白一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。
挑取高表达人YQXM的Sf9细胞克隆。
(3)YQXM编码蛋白提取纯化用高表达YQXM编码蛋白的Sf9细胞克隆的上清大量感染Sf9细胞，感染48小时后收集细胞，PBS洗涤。每2×108细胞加入20ml细胞裂解液(0.5％TritonX-100，20mM Na3PO4(磷酸钠，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(钒酸钠)，1mMPefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20min去除细胞碎片，上清按每2×108的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mM N，N′-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测提取的YQXM编码蛋白的纯度。根据分子量识别YQXM编码蛋白。
实施例5抗YQXM编码蛋白抗体的制备(1)免疫小鼠和脾细胞的制备将实施例3中获得的人YQXM蛋白用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备，制备饲养细胞，和细胞融合按常规方法进行。
(2)抗体的检测在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用人YQXM蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。
结果表明，分离出的抗体可以与YQXM蛋白发生特异性结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>同济大学<120>心房颤动致病基因及其用途<130>046553<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>809<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(141)..(512)<223>
<400>1gtaaggtgaa ggtgcccagc aggctgaggc ttgtgtgcaa cccagaagag agctcgctaa 60cgccagcaag aaggttcaga acagcctggc tttggaaagg aatttcatcc tgcccacaca120ctgcatagca ggagggaagc atg tct act tta tcc aat ttc aca cag acg ctg173Met Ser Thr Leu Ser Asn Phe Thr Gln Thr Leu1 5 10gaa gac gtc ttc cga agg att ttt att act tat atg gac aat tgg tgc 221Glu Asp Val Phe Arg Arg Ile Phe Ile Thr Tyr Met Asp Asn Trp Cys15 20 25cag aac aca aca gct gag caa gag gcc ctc caa gcc aaa gtt gat gct 269Gln Asn Thr Thr Ala Glu Gln Glu Ala Leu Gln Ala Lys Val Asp Ala30 35 40gag aac ttc tac tat gtc atc ctg tac ctc atg gtg atg att gga atg 317Glu Asn Phe Tyr Tyr Val Ile Leu Tyr Leu Met Val Met Ile Gly Met45 50 55ttc tct ttc atc atc gtg gcc atc ctg gtg agc act gtg aaa tcc aag 365Phe Ser Phe Ile Ile Val Ala Ile Leu Val Ser Thr Val Lys Ser Lys60 65 70 75aga cgg gaa cac tcc aat gac ccc tac cac cag tac att gta gag gac 413Arg Arg Glu His Ser Asn Asp Pro Tyr His Gln Tyr Ile Val Glu Asp80 85 90
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<400>3ctccctccca cctttacata gc 22<210>4<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4tgtctggacg tcagatgtta gc 2权利要求
1.一种分离的YQXM多肽，其特征在于，它选自下组具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列RIFITYMDNWCQNTTAEQE的保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)与(a)中所述多核苷酸互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸含有选自下组的核苷酸序列(1)编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(2)SEQ ID NO1中1-809位的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO1中141-512位的核苷酸序列；
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的载体转化或转导的宿主细胞。
7.一种制备人YQXM多肽的方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人YQXM多肽。
8.一种能与权利要求1所述的人YQXM蛋白特异性结合的抗体。
9.一种检测心房颤动的试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增人YQXM的引物对，(2)用于检测扩增产物与野生型KCNE2相比是否存在变化所需的试剂。
10.一种制备遗传性心房颤动的动物摸型的方法，所述的动物是非人哺乳动物，其特征在于，该方法包括步骤(a)将一种遗传构建物转入动物细胞，所述的遗传构建物包括5′同源臂和3′同源臂，以及位于同源臂之间的供筛选的标记基因和引入YQXM外显子的突变元件，所述的突变元件是编码RIFITYMDNWCQNTTAEQE的核苷酸序列，并且所述的5′同源臂和3′同源臂分别同源于基因组中人YQXM外显子的突变元件上游和下游的核苷酸序列；(b)通过同源重组，获得基因组整合入有突变元件的动物细胞；(c)从步骤(b)的动物细胞再生获得转基因动物。
全文摘要
本发明公开了一种新的人类心房颤动致病基因(YQXM)及其编码蛋白。该YQXM是KCNE2基因的一种突变体，核苷酸突变位点发生在KCNE2的第219位(编号按Genbank登录号No.NM 172201)。此外，本发明还涉及YQXM核苷酸序列和编码蛋白的制备方法和用途。
文档编号A01K67/00GK1746186SQ20041006626
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者陈义汉, 刘懿, 杨奕清 申请人:同济大学