专利名称：一种日本沼虾多倍体的诱导方法
技术领域：
本发明涉及虾类育种技术，尤其是涉及一种日本沼虾多倍体的诱导方法。
背景技术：
虾类中的对虾不抱卵，卵子受精后即分散于水中自行发育，不依赖母体。因此在虾类中，对虾的种间杂交率先取得突破。如中国专利971060967公开的一种“三倍体对虾育苗方法”，该方法包括改对虾夜间产卵为白天产卵和用6-DMAP作诱导剂诱导对虾三倍体以及用流式细胞计检测倍性这样三个步骤。因此根据对虾的不抱卵特征，用该方法可批量育出三倍体对虾菌种。
而沼虾类为抱卵虾，其繁殖方式非常特殊。沼虾类受精卵粘于母虾腹部，整个发育过程都不能离开母体，即具有抱卵现象。长期以来，沼虾类多倍体的诱导一直是一个未能突破的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种用细胞松驰素B诱导日本沼虾多倍体的方法，该方法可操作性强、诱导率高且稳定、适于三倍体沼虾苗种的规模生产。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该方法包括(1)亲虾的培育与促产将雌雄虾养于水温恒定在18～22℃之间的同一网箱内，让其自然交配产卵；(2)抱卵虾采集与处理检查雌虾的抱卵情况，并将抱卵的雌虾取出，另箱暂养，把开始产卵的时间记为受精零时；(3)用细胞松驰素B(C.B)作诱导剂进行三、四倍体诱导处理a.C.B液的配制将细胞松驰素B(C.B)溶于0.01％二甲基亚砜(DMSO)，配成浓度为1.5mg/L的C.B溶液；b.三、四倍体的诱导处理将培育好的抱卵虾取出，迅速用纸吸干虾身上的水份，放入已配制好的C.B溶液中进行诱导处理；处理完毕后，用池水清洗两遍，将母虾小心放入网箱中孵化，常规管理；当池中出现蚤状幼体时，速将抱卵虾移至另一池中继续孵化，以免母虾吞食幼体；(4)存活率统计与倍性鉴定四个步骤。
在上述(3)的三、四倍体诱导处理，水温最好控制在18～19℃，三倍体诱导处理的起始时刻为受精后5～10分钟，处理持续时间为20分钟；四倍体诱导处理的起始时刻为受精后7～8小时，处理持续时间为20分钟；亦可将水温控制在22～23℃，而此温度三倍体诱导处理的起始时刻为受精后5～8分钟，处理持续时间为15～20分钟；四倍体诱导处理的起始时刻为受精后5.5～6.5小时。
与现有技术相比，本发明的优点在于三倍体和四倍体诱导率稳定，用四倍体与二倍体杂交可产生全三倍体的日本沼虾苗种，适用于规模化三倍体菌种的生产。
具体实施例方式
以下结合附图
实施例对本发明作进一步详细描述。
1、亲虾的培育与促产选择雌虾体长5-8cm，体重6-8g；雄虾体长7--10cm，体重7--10g。收集的亲虾雌雄分开，暂养在置于土池中的网箱内。依水温变化每天投喂一定量的新鲜小杂鱼。待水温稳定在18℃以上后，将亲虾转入用于交配促产的置于室内水泥池中的网箱内，雌雄按1∶2比例并箱促产，让其自然交配产卵。充气增氧，每天换水1/5。全期水温恒定在18℃-22℃之间。
2、抱卵虾采集与处理于雌雄并箱的翌日凌晨4时起每小时检查抱卵情况，并将抱卵虾取出，另箱暂养待处理。把开始产卵的时间记为受精零时。
3、C.B液配制与三、四倍体诱导细胞松驰素B(C.B)为美国Sigma公司产品，现配现用。将C.B溶于0.01％二甲基亚砜(DMSO)，C.B配成浓度1.5～2.0mg/L，其中以浓度1.5mg/L为最佳。
控制水温，将自然顺产的抱卵虾培育至预定处理时间，取出抱卵虾，迅速用纸吸干虾身上的水份，放入置C.B溶液的脸盆中，按设计时间处理。处理完毕后，用池水清洗两遍，将母虾小心放网箱中孵化，常规管理。当池中出现蚤状幼体时，速将抱卵虾移至另一池中继续孵化，以免母虾吞食幼体。
三倍体与四倍体诱导条件控制水温 处理目的C.B浓度 处理起始时刻处理持续时间18～19℃ 三倍体诱导 1.5mg/L 受精后5-10分钟 20分钟四倍体诱导 1.5mg/L 受精后7～8小时 20分钟22～23℃ 三倍体诱导 1.5mg/L 受精后5-8分钟 15-20分钟四倍体诱导 1.5mg/L 受精后5.5～6.5小时 15-20分钟其中水温最好控制在18～19℃。
4存活率统计与倍性鉴定倍性鉴定在多细胞期进行。用500μg/l秋水仙碱于20℃下培养1h，在37℃水浴锅中用0.1M的KCl低渗溶液处理40-50min，移去低渗液，缓慢加入预冷的卡诺氏固定液，4℃下静止1h，其间更换固定液2次。然后改用1∶1的甲醇和冰醋酸液固定。制片时，取单个胚胎置于载玻片上，滴上1-2滴50％醋酸使其软化，并除去部分卵黄物质。日产Olympus显微镜下镜检并拍照。青虾的2n染色体数约为104左右，一般以染色体数156左右为三倍体，208左右为四倍体。
权利要求
1.一种日本沼虾多倍体的诱导方法，其特征在于该方法包括(1)亲虾的培育与促产将雌雄虾养于水温恒定在18～22℃之间的同一网箱内，让其自然交配产卵；(2)抱卵虾采集与处理检查雌虾的抱卵情况，并将抱卵的雌虾取出，另箱暂养，把开始产卵的时间记为受精零时；(3)用细胞松驰素B(C.B)作诱导剂进行三、四倍体诱导处理a.C.B液的配制将细胞松驰素B(C.B)溶于0.01％二甲基亚砜(DMSO)，配成浓度为1.5～2.0mg/L的C.B溶液；b.三、四倍体的诱导处理将培育好的抱卵虾取出，迅速用纸吸干虾身上的水份，放入已配制好的C.B溶液中进行诱导处理；处理完毕后，用池水清洗两遍，将母虾小心放入网箱中孵化，常规管理；当池中出现蚤状幼体时，速将抱卵虾移至另一池中继续孵化，以免母虾吞食幼体；(4)存活率统计与倍性鉴定。
2.如权利要求1所述的日本沼虾多倍体的诱导方法，其特征在于在作三、四倍体诱导处理时，水温控制在18～19℃，三倍体诱导处理的起始时刻为受精后5～10分钟，处理持续时间为20分钟；四倍体诱导处理的起始时刻为受精后7～8小时，处理持续时间为20分钟。
3.如权利要求1所述的日本沼虾多倍体的诱导方法，其特征在于在作三、四倍体诱导处理时，水温控制在22～23℃，三倍体诱导处理的起始时刻为受精后5～8分钟，处理持续时间为15～20分钟；四倍体诱导处理的起始时刻为受精后5.5～6.5小时，处理持续时间为15～20分钟。
4.如权利要求1所述的日本沼虾多倍体的诱导方法，其特征在于所述的倍性鉴定在多细胞期进行。
全文摘要
一种用细胞松弛素B诱导日本沼虾三倍体和四倍体的方法。将受精卵与母体一起孵育，用细胞松弛素B处理，保持一定药物浓度，掌握起始时间和持续处理时间，通过抑制第二极体的排放和受精卵的第一次卵裂，分别获得三部体和四倍体幼体。本发明方法可操作性强、诱导率高且稳定、用四倍体与二倍体杂交可产生全三倍体的日本沼虾苗种，适用于规模化三倍体苗种的生产。
文档编号A01K61/00GK1600089SQ20041006744
公开日2005年3月30日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者钱国英 申请人:钱国英