专利名称：：多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂、及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物农药可湿性粉剂及其应用和制备方法。更具体地说，本发明涉及一种多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，以及该多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物细菌性和真菌性土传病害以及叶部病害方面的应用。
背景技术：
：近年来，随着环境的恶化、作物连作以及单一种植，土传病害和叶部病害的发生越来越严重，这已经严重影响了整个农业的发展。因此，解决土传病害和叶部病害显得越来越重要。对植物细菌性和真菌性土传以及叶部病害(如青枯病、枯萎病、角斑病、叶斑病等)，到目前为止还没有很好的化学农药进行防治，主要原因是这些病害容易对化学农药产生抗药性。现在研制和开发微生物农药来防治植物细菌性和真菌性土传以及叶部病害受到国内外的广泛关注。现在土传病害的防治一般采取如下方法轮作、品种选育、栽培防病(如深沟高畦栽培、嫁接防病等)、土壤消毒(如石灰消毒、高温消毒等)、药剂防治(防治真菌性土传病害土菌消、敌克松、绿亨一号、五氯硝基苯、根腐宁、恶霉灵、多菌灵、托布津等；防治细菌性土传病害水合霉素、农用链霉素、络氨铜等)。但上述方法中有些在使用时受到限制或对技术要求较高，如轮作、嫁接等；而有些药剂对土传病害的防治效果不理想，特别是后期防效很差。而叶部病害的防治一般采取如下方法轮作、品种选用、种子处理、土壤处理、栽培管理、药剂防治(防治真菌性叶部病害纳农蔬福、普力克、安克锰锌、菌立灭、易保、克露、755猛杀生干、百菌清、托布津、多菌灵、代森锌、代森铵、炭疽福、农抗120等；防治细菌性叶部病害可杀得、丰护安、绿乳铜、细菌净、农用链霉素、新植霉素、DT杀菌剂、抗菌剂401、DTM、甲霜铝铜等)。由上述防治所使用的药剂可知，虽然现在市场上有可同时防治土传病害和叶部病害的药剂，如多菌灵、农用链霉素、托布津等，但其防效不理想，特别是后期防效很差。更没有可以同时防治植物细菌性和真菌性土传以及叶部病害的药剂，如多菌灵和托布津一般是防治真菌性病害，而农用链霉素一般用来防治细菌性病害。此外，上述药剂全是以化学物质为有效成分的农药，而非微生物农药。在微生物农药的研制与开发中，剂型的开发起着至关重要的作用。它决定一个生物防治用的菌株(下文简称"生防菌")是否能够真正形成产品。很多在实验室成功筛选出的生防菌株却在田间应用时失败，其主要原因就是剂型问题没有得到很好的解决。与化学农药相比，微生物农药剂型加工更困难。首先，微生物是不溶于水的生物体，其颗粒大小可以从不足0.5nm到lOpm以上，这种颗粒的疏水性直接影响制剂的润湿性、分散性和悬浮性等物理性能。其次，作为活的生物体，微生物对外界环境因素如温度、湿度和光照等比较敏感，制剂贮存稳定性差，作用速度慢。微生物作为活体，与各种助剂的相容性一般比化学农药差，某些助剂可能完全不能使用。因此，微生物农药的剂型加工好坏或制剂化程度的高低已成为制约微生物农药成功开发的瓶颈。我国已商品化的一些微生物农药和农用抗生素已涵盖了目前化学农药所涉及的剂型。如荧光假单胞杆菌有水剂和粉剂，蜡质芽孢杆菌有可湿性粉剂和悬浮剂，苏云金芽孢杆菌的剂型种类比较多，有颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂和悬浮剂等。微生物农药的剂型加工很大部分是模仿化学农药进行的，只有少部分是微生物农药特有的。目前微生物农药剂型加工也逐渐从水基制剂向油基制剂，从液体制剂向固体制剂，从粉末制剂向颗粒状制剂方向发展。但是，由于生防菌株很容易从产品中分离获取，微生物农药剂型是对微生物农药技术秘密的最有效的保护。因此，有关微生物农药剂型的研究很少有文献报道。目前，我国微生物农药剂型的研究还不够深入，主要表现为剂型单一、缺乏高水平的剂型、制剂质量不稳定(贮存期短)、助剂(保护剂和增效剂等)研究不够以及剂型不规范和名称混乱等。相当多微生物农药制剂产品的指标，达不到质量标准的要求，或其标准所规定的指标比国外同类品种的指标要低得多，于是出现了含水量偏高、悬浮率低、稳定性差等现象，使微生物农药的效果得不到充分的发挥。关于微生物活菌制剂可湿性粉剂方面的内容已公开了相关专利。US5304376和EP0381290公开了一种由真菌产生的物质的可湿性粉剂及其制备，主要用来防治由真菌病原菌引起的植物病害。加拿大专利(专利号2367775)公开了一株可防治植物真菌病害的短小芽孢杆菌(NRRLNo.B-30087)，并介绍了几种制剂剂型，其中含有细粒剂、液体悬浮剂、可湿性粉剂、微胶囊剂和可乳化浓縮剂，但是没有涉及如何制备可湿性粉剂。CN1232873公开了一种芽孢乳酸菌粉剂的生产方法，其主要内容是通过发酵的发酵液和麦芽糊精搅拌均匀后喷雾干燥，从而得到含耐热芽孢乳酸菌活菌浓度较高的粉剂。该专利只是涉及到了该粉剂的整个生产过程，没有涉及该粉剂的应用对象，也没有说明其喷雾干燥操作工艺，更没有提及采取的是何种喷雾干燥方式。CN1237346公开了一种枯草芽孢杆菌菌剂、制法及其使用方法。该发明中的菌剂含有菜丰宁B1菌株、菜丰宁B2菌株、麦丰宁B3菌株，活菌总量为5亿/克以上。发酵液与吸附剂混合后，粉碎过筛，得到粉剂。采用拌种、灌根、蘸根、喷雾等方法进行种子处理或苗期处理来防治小麦纹枯病。中国专利CN1415210和CN1723780分别公开了一种真菌孢子可湿性粉剂，但其主要内容只是涉及载体、助剂、保护剂等的配比，并且其可湿性粉剂是由商品化的高含量的孢子粉和载体、助剂以及保护剂通过机械混合而得到的。其目的只是通过助剂和保护剂的作用提高真菌孢子粉的贮存期和所述粉剂能够在生产、贮存、应用过程中保证孢子的生物活性和防治效果。中国专利CN1255541公开了"一种枯草芽孢杆菌菌株、制法、制剂及应用"，枯草芽孢杆菌培养物和膨润土及高岭土配制成可湿性粉剂，主要用来防治苹果霉心病和枝干病害等。中国专利CN1398521公开了一种防病微生物农药可湿性粉剂，所述可湿性粉剂由两种芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌N,和芽孢杆菌N》发酵的发酵液和稳定剂、助剂混合后，通过高压喷雾干燥而得。所得可湿性粉剂用来防治小麦全蚀病、蔬菜立枯病、灰霉病和疫病。中国专利CN1421139公开了一种含有苏云金芽孢杆菌的悬浮剂和可湿性粉剂的方法，其可湿性粉剂制备方法为将一定比例的原料混合后利用气流粉碎机粉碎到一定细度的粉剂即可，方法简单，其主要目的是为了提高复配农药的杀虫效果。由上述公开的微生物农药可湿性粉剂的专利可知，它们涉及到的可湿性粉剂制备方法大都是采用粉碎法和压力喷雾干燥法，未见直接说明是采用离心式喷雾干燥法来制备可湿性粉剂的。在多粘类芽孢杆菌的专利方面，CN1353182公开了一株多粘类芽孢杆菌中的对稻瘟病具有拮抗作用的抗真菌蛋白及其基因。CN1844360公开了一株多粘类芽孢杆菌利用豆渣生产微生物絮凝剂的生产工艺。CN1475467公开了一种含有多粘类芽孢杆菌的生物肥料，主要用于竹林培育。CN1414093公开了一种直接分解秸秆为肥的微生物肥料菌剂，在该菌剂中一共有10种细菌，其中含有多粘类芽孢杆菌，其主要用途是有效利用秸秆等能源并提供环境友好的生物肥料。CN1687399公开了一种防病促生长植物内生多粘类芽孢杆菌，其主要内容只是涉及该菌的特征、形态和防病机理，并利用几种植物病原菌进行了抑菌谱测定。该专利并没有涉及多粘类芽孢杆菌制剂，也没有利用该菌的制剂在田间进行防治试验。US6602500公开了一株多粘类芽孢杆菌ATCC202127，其产生的蛋白可以抑制真菌的生长，特别是丄印tos/7/mm'fl5^。专利WO/2006/016558中也涉及到了多粘类芽孢杆菌，但只是公开了几株对植物病害有防治作用的菌株和产生的物质，没有涉及到利用多粘类芽孢杆菌制备成制剂及其制剂的大田防治试验。专利WO/2002/072795发现了几株对植物病害具有防治作用的菌株，其中包括多粘类芽孢杆菌。由本发明人发明的中国专利ZL02151019.9、PCT申请(WO2004/050861)和美国专利(US2006/0018883)主要涉及一种多粘类芽孢杆菌细粒剂及其在植物病害防治方面的用途。虽然该细粒剂在田间对青枯病表现较好的防治效果，但由于细粒剂在大面积使用时暴露出来的不能喷雾、有效成分即活菌含量低、使用前需长时间浸泡等问题，影响了多粘类芽孢杆菌细粒剂的大面积推广。而关于多粘类芽孢杆菌的芽孢培养工艺、可湿性粉剂制备以及利用该可湿性粉剂进行的药剂复配及其利用该可湿性粉剂和复配药剂来进行植物病害防治，未见文献报道。虽然目前利用细菌和真菌作为有效成分开发成微生物农药可湿性粉剂的专利较多，但大部分是利用已经商品化的原药来进行载体、助剂和保护剂等的筛选以提高防效或贮存期，并且其制备方式一般为压力式喷雾或机械混合后粉碎而得可湿性粉剂，未见活菌制剂利用离心式喷雾法来制备的专利。而关于多粘类芽孢杆菌的专利，主要是关于其抗菌蛋白、絮凝剂和菌肥，即使涉及到利用该菌来防治植物病害，也只有本发明人以前发明的细粒剂及其用于植物病害的田间防治，其它的大部分专利还停留在实验室阶段，没有形成制剂，更没有利用形成制剂的产品在田间防治植物病害。也没有一个专利是涉及到多粘类芽孢杆菌芽孢形成和将多粘类芽孢杆菌制备成可湿性粉剂。利用多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂进行药剂复配也未见文献报道。虽然由本发明人发明的专利和/或申请(ZL02151019.9、WO2004/050861、US2006/0018883)涉及到了多粘类芽孢杆菌细粒剂，但并未涉及可湿性粉剂，也没有涉及到多粘类芽孢杆菌是芽孢状态还是非芽孢状态，并且其主要防治对象是青枯病。因此，研究多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的成分及其加工方法与应用，有利于进一步开发多粘类芽孢杆菌的用途，使其更好地被用来防治植物细菌性和真菌性土传和叶部病害，促进农药，特别是微生物农药产品产业化的发展。
发明内容本发明的目的是为了提供一种可防治植物细菌性和真菌性土传病害以及叶部病害的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。本发明对已经在大田对土传病害表现良好防治效果的多粘类芽孢杆菌进行培养，获得高活菌含量的发酵液，然后将其与载体和助剂混合后，经过离心喷雾干燥得到一种可湿性粉剂，该可湿性粉剂可有效防治细菌性和真菌性土传病害和叶部病害，从而完成了本发明。本发明第一方面提供了多粘类芽孢杆菌(户ae"/^c///^/w/少m;;;ra)培养基和培养工艺的优化，以期获得较为合适的可以进行可湿性粉剂生产的多粘类芽孢杆菌发酵液。本发明第二方面提供了一种制备上述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的方法，该方法包括将多粘类芽孢杆菌发酵液、载体、助剂混合，得到固含量重量百分比为5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的进风温度、每小时5kg200kg料的进料速度下经离心喷雾干燥，得到所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂中的活菌含量为lxl07cfb/glxl012cfU/g;所述载体选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土中的一种或多种；所述助剂包括润湿剂和分散剂，其中润湿剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、丁基萘磺酸钠、烷基萘磺酸盐中的一种或多种，分散剂选自六偏磷酸钠、羟甲基纤维素钠、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸盐縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸盐縮聚物钠盐、黄原胶、(3—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的一种或多种。本发明第三方面涉及本发明的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物细菌性和真菌性土传病害及叶部病害中的应用。本发明首次将多粘类芽孢杆菌开发成微生物农药可湿性粉剂，其对病害的防治范围广、防效高，不仅能有效地防治植物细菌性和真菌性土传病害，而且对细菌性和真菌性叶部病害也具有很好的防效。该可湿性粉剂不仅可以单独使用，而且也可以和其它微生物农药和助剂复配来使用。具体实施方式本发明第一方面提供了一种多粘类芽孢杆菌(尸aem'^c/〃wjw/;^y;ra)可湿性粉剂，它由多粘类芽孢杆菌、载体和助剂组成，所述多粘类芽孢杆菌在可湿性粉剂中的活菌含量为Ixl07cfo/glxl012cfii/g。在一个较佳的实施方案中，所述载体选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土中的一种或多种；所述助剂包括润湿剂和分散剂，其中润湿剂选自十二垸基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、丁基萘磺酸钠、烷基萘磺酸盐中的一种或多种，分散剂选自六偏磷酸钠、羟甲基纤维素钠、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸盐缩聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸盐縮聚物钠盐、黄原胶、(3—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的一种或多种。在另一个较佳的实施方案中，所述多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌HY96-2，其保藏号为CGMCCNo.0829。关于该菌株的鉴定和其它信息可参见中国专利ZL02151019.9，该文全部内容纳入本文作为参考。然而，本领域技术人员应当理解，本发明的实施并不局限于这一具体的多粘类芽孢杆菌菌株。在本发明的另一较佳的实施方案中，所述润湿剂优选为十二垸基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐中的1种或2种，所述分散剂优选为烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐和P—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的1种或2种。上述助剂包括润湿剂和分散剂，所述润湿剂在可湿性粉剂中的重量百分比通常为0.01%10%，较佳为0.1%5%，更佳为1%3%;所述分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比通常为0.01%10%，较佳为0.1%5%，更佳为1%3%。本发明上述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂可用以下方法获得，该方法包括将含有多粘类芽孢杆菌活菌的发酵液、载体和助剂混合，得到固含量重量百分比为5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的进风温度、每小时5kg200kg料的进料速度下经离心喷雾干燥，得到所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。本发明所用的术语"发酵液"、"活菌"、"载体"、"助剂"、"可湿性粉剂"、"土传病害"、"叶部病害"、"离心喷雾"等具有本领域技术人员通常熟知且承认的含义。在一个较佳的实施方案中，所述多粘类芽孢杆菌活菌来自多粘类芽孢杆菌发酵液，所述发酵液含有芽孢状态的多粘类芽孢杆菌活菌、非芽孢状态的多粘类芽孢杆菌活菌、和/或所述多粘类芽孢杆菌的代谢产物。所述发酵液可通过在适合生长的条件下培养多粘类芽孢杆菌(具体例如上述的多粘类芽孢杆菌HY96-2)，使其生长至一定的浓度来获得。用于培养本发明中菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其它营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉等。氮源可以是蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等。培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在培养时可采用豆油、泡敌等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在5.58.0之间，培养温度宜在2537T:之间。培养时间通常在12h72h之间，最终的菌浓度通常可高达5xlO、fli/mllxlOUcfU/ml。在本发明的一个较佳的实施方案中，宜使所述发酵液中含有较高含量的芽孢，以赋予微生物耐高温的特性，以便在后续的喷雾干燥过程中获得更高的活菌含量。为了获得含芽孢的多粘类芽孢杆菌发酵液，通过培养基中的碳、氮源和无机盐的优化得到了较合适的培养基组份，并且通过调节培养过程中的气液比、转速来改变培养环境的溶氧水平(DO)，通过调节培养基的pH和延长培养时间，可以使培养过程中的活菌芽孢率在0100%之间变化，较佳的是使活菌芽孢率在10%以上，更佳的是在30%以上，还要佳的是在50%以上。在本发明的一个较佳的实施方案中，所述多粘类芽孢杆菌通过以下方法培养获得在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中，在通气量控制在气液比为0.2:12:1、转速在100r/min或以上，培养所述多粘类芽孢杆菌24小时以上，发酵结束时的培养基pH控制为7.09.0，其中所述碳源选自葡萄糖、淀粉和大米粉中的1种或几种，所述氮源选自蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和大豆粉中的l种或几种，所述无机盐除了常规的无机盐(如MgS04、(NH4)2S04、KH2P04、NaCl、K2HP04和CaC03夕卜)还包含Mn2+，该Mn2+的浓度宜为0.005%0.01%。上述列举的这些参数只是实现本发明的较佳方案。因此，本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得本发明的发酵液。所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂中的载体和助剂对本发明的多粘类芽孢杆菌活菌体、发酵液以及可湿性粉剂防治植物病害的生物效果无影响。所述载体可选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土及其混合物，其中较佳的载体是白碳黑、硅藻土、淀粉和轻质碳酸钙中的一种或多种。助剂包括润湿剂和分散剂，其中润湿剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二垸基硫酸钠、丁基萘磺酸钠、烷基萘磺酸盐中的一种或多种，分散剂选自六偏磷酸钠、羟甲基纤维素钠、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸盐縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸盐缩聚物钠盐、黄原胶、P—萘磺酸盐缩聚物钠盐中的一种或多种。在上述润湿剂和分散剂中，较佳的是润湿剂为十二垸基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐中的l种或2种；所述分散剂为烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐和J3—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的l种或2种。润湿剂和分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比皆为0.01%10%。上述这些载体和助剂均可市售购得。载体细度要求通过44pm筛的比例大于95y。，更佳为大于98%。为了便于长期贮存，将发酵液与载体、助剂按照一定的比例混合后(固含量重量百分比为5%50%)得到的液固混合物，分别采用压力式喷雾和离心式喷雾来试制可湿性粉剂。由于压力式喷雾后的产品中的活菌含量较低(不足10、fo/g)，而离心式喷雾得到的可湿性粉剂活菌含量都高于10、fo/g，故采用如下的离心喷雾干燥工艺来生产高活菌含量的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂离心转子转速700015000r/min、进风温度100。C300。C(优选为150。C250。C，更佳为180。C220'C)、风量10008000m3/h、物料的进料速度5kg/h200kg/h(根据进料的固含量、进风温度和出风温度来调整)、设备负压1001000Pa、气锤频率0.11Hz。上述可湿性粉剂干燥步骤采用本领域中的常规技术，例如但不局限于离心式喷雾干燥。为了能使多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂中的有效成分尽可能保持较高的含量和较长的je存期，含有多粘类芽孢杆菌的可湿性粉剂含水量的重量百分比宜控制在小于20%，更佳为小于15%。在一个较佳的实施方案中，本发明涉及的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂其活菌含量为lxl()7dWglxl(^cfo/g，细度(通过44pm筛)大于95%，悬浮率大于34%，润湿时间小于180s，满足国家对农药可湿性粉剂的要求D本发明中涉及的防治植物细菌性和真菌性土传及叶部病害的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂使用方法就是农业中常用的灌根和喷雾的方法。上述用药方法，如将可湿性粉剂稀释一定倍数后对植物进行灌根的方法和稀释后利用喷雾设备进行喷雾的方法是本领域中的常规技术。本发明者还发现，本发明的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂不仅可以通过灌根来防治植物细菌性和真菌性土传病害，如青枯病、枯萎病、软腐病、根腐病、茎基腐病、猝倒病、立枯病等，而且可以通过喷雾来防治细菌性和真菌性叶部病害，如角斑病、赤星病、叶斑病、斑枯病、溃疡病、穿孔病、炭疽病、灰霉病、霜霉病等。本发明的内容、优点和目的可从下文进一步详细描述中清楚地得知。实施例1多粘类芽孢杆菌发酵液中芽孢培养工艺本实施例通过培养基成分的优化和改变培养条件来实现多粘类芽孢杆菌的芽孢培养工艺。方法(1)培养基的优化本实施例从淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米等中筛选出合适的碳源。从蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐等中筛选出合适的氮源。从氯化钠、磷酸盐、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐中筛选出合适的无机盐。以发酵液中的芽孢率高低为筛选标准，综合考虑发酵液的活菌含量。本实施例的筛选步骤如下先采用单因子试验进行碳、氮源的筛选，再采用正交试验进行选定碳、氮源浓度的筛选。上述的单因子试验和正交试验为本领域技术人员通常熟知且承认的培养基优化的方法。(2)培养工艺的优化本实施例通过改变如下发酵参数来控制多粘类芽孢杆菌发酵液中的活菌芽孢率通气量、转速、pH、培养时间。结果与分析(1)培养基的优化本部分发明考察了几种常用的碳、氮源和无机盐对多粘类芽孢杆菌产芽孢的影响。不同碳源对多粘类芽孢杆菌培养后的芽孢和活菌含量影响见表1。由表可见，从菌体芽孢率的高低来看，葡萄糖、淀粉和大米粉是比较合适的碳源。表1不同碳源对多粘类芽孢杆菌活菌及芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐中选出几种氮源，考察不同氮源对多粘类芽孢杆菌培养后的芽孢和活菌含量的影响，部分结果见表2。由表可见，从菌体芽孢率的高低来看，蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和大豆粉是比较合适的氮源。表2不同氮源对多粘类芽孢杆菌活菌及芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上面的单因子试验结果，选出葡萄糖、淀粉、大米粉、蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和大豆粉作为碳、氮源作进一步的筛选，通过正交试验确定碳氮源合适的使用浓度，以芽孢率的高低为主要筛选标准，参考发酵液的活菌含量，最后得到的比较合适的碳氮源重量百分含量为葡萄糖0.1°/。3%;淀粉0.5%3%;大米粉1%3.5%;蛋白粉0.01%3%;酵母粉0.01%4%;花生饼粉0.5%4%;大豆粉0.2%4.5%。在多粘类芽孢杆菌的培养基中，已经含有部分无机盐，故本部分试验在其它无机盐种类和含量不变的情况下，优化了Mr^+浓度对多粘类芽孢杆菌培养后的芽孢和活菌含量的影响，其结果见表3。表3不同Mi^对活菌及芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表3可知，随着Mi^+浓度的增加，芽孢率先增加，后减少，故最后确定Mn^的重量百分含量为0.005%0.01%左右。(2)培养工艺的优化本部分发明考察了通气量和转速的改变来改变DO以及pH的调节和培养时间的延长对多粘类芽孢杆菌产芽孢的影响。发酵结果表明，当多粘类芽孢杆菌在上述优化后的培养基中发酵时，气液比(每小时通气量(m3)与发酵液体积(m3)的比)由0.2:1调整为2:1时，发酵不同时间后的芽孢率如下表4。表4不同通气量对芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4可知，当通气量加大时，芽孢形成时间提前。在2:l的气液比下，24h就可观察到有芽孢形成，在44h时，其芽孢率可达100%;而0.2:1的气液比在32h才观察到有芽孢形成，在48h时，其芽孢率才为80%。由此可知，加大通气量，可以縮短芽孢形成的时间，提高芽孢率。由表4数据也可知，发酵时间的延长有利于芽孢率的提高。发酵罐搅拌速度对多粘类芽孢杆菌发酵液中活菌芽孢率(以培养36h为参考)的影响见表5。由该表可见，在其它发酵条件不变的情况下，当搅拌转速逐渐升高时，发酵液中的活菌芽孢率逐渐提高。由此可见，提高搅拌速度可以提高芽孢率。表5不同搅拌转速对芽孢形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>此外，通过调节发酵液的pH考察了pH对多粘类芽孢杆菌芽孢率的影响。当通过自动补加酸碱来控制整个培养过程中发酵液的pH在7左右时，即使在发酵时间为36h时，菌体也没有芽孢形成。当pH调节为偏碱时(pH为7.09.0)，芽孢大量形成。由此可知，可以通过调节发酵液的pH来控制多粘类芽孢杆菌芽孢率的高低。综合该部分的结果，多粘类芽孢杆菌芽孢培养工艺为培养基中除了基本的无机盐外，其它的成分及其重量百分含量为葡萄糖0.1%3%;淀粉0.5%3%;大米粉1%3.5%;蛋白粉0.01%3%;酵母粉0.01%4%;花生饼粉0.5%4%;大豆粉0.2%4.5%;Mn2+:0.005%0.01%，通气量控制在气液比为0.2:12:1，转速控制在100r/min或以上，发酵结束时的培养基pH控制在偏碱(pH为7.09.0)，培养时间大于24h。实施例2多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体的选择本实施例从白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土及其混合物中筛选适合多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的载体，以产品中的活菌含量高低作为筛选标准。多粘类芽孢杆菌HY96-2按照实施例1所述的培养工艺进行培养，得到多粘类芽孢杆菌发酵液。然后将上述载体逐步加入所述多粘类芽孢杆菌发酵液中，混合至载体完全润湿但无明显游离水后，将混合物放在烘箱中干燥后碾磨，得到细粉。由于不同载体吸附能力不同，因此单位重量的载体吸附的发酵液重量不尽相同。测定干燥前后样品的活菌量。活菌含量的测定采用本领域技术人员通常熟知且承认的稀释涂平板法。结果与分析本发明利用同一批多粘类芽孢杆菌的发酵液和不同载体混合后制备成制剂，干燥后其活菌含量分别为白碳黑5.7xl0、fii/g，硅藻土2.8xl0、fb/g、淀粉5.9xl0ScfU/g、高岭土4.8xl08cfU/g、滑石粉1.0xl08cfo/g、膨润土9.9xl07cfo/g、轻质碳酸钙8.3xl08cfo/g、凹凸棒土6.8x107cfo/g、草炭土5.6xl0cfo/g。其中，白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、高岭土作为载体制备的制剂的活菌含量比较高，故从制剂的活菌含量来看，适合于制备高含量活菌可湿性粉剂的载体可选用白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙和高岭土。实施例3多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂助剂的筛选本实施例筛选的助剂包括润湿剂和分散剂。本实施例从十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、丁基萘磺酸钠、烷基萘磺酸盐中筛选合适的润湿剂；从六偏磷酸钠、羟甲基纤维素钠、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸盐縮聚物、聚乙烯、烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐、黄原胶、|3—萘磺酸盐縮聚物钠盐中筛选合适的分散剂。润湿剂的筛选以可湿性粉剂润湿时间的长短作为筛选标准，时间越短，润湿效果越好；分散剂的筛选以可湿性粉剂的悬浮率高低作为筛选标准，悬浮率越高，效果越好。本实施例的助剂筛选步骤如下将上述已经筛选好的载体和按照实施例1所述的培养工艺进行培养获得的发酵液混合后干燥，碾磨得到粉末状物质，再分别与润湿剂或分散剂以一定比例混合均匀，分别测定各样品的润湿时间和悬浮率。润湿时间和悬浮率的测定方法为本领域技术人员通常熟知且承认的方法，具体可参考农药可湿性粉剂国家标准中的相应部分。结果与分析(1)润湿剂的滩选本部分发明考察了几种常用润湿剂对以白碳黑、硅藻土、淀粉和轻质碳酸钙为载体的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间的影响(见表6)。表中对照1为水和载体混合样品、对照2为灭菌后空白培养基和载体混合样品、对照3为发酵液和载体混合样品。表6显示了加入不同润湿剂后样品的润湿时间。由表可知，加了润湿剂的样品润湿时间明显少于对照l、2和3，其中十二烷基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐的效果最为明显。根据润湿时间越短润湿性越好的原则，选择十二烷基苯磺酸钠和垸基萘磺酸盐作为合适的润湿剂。表6润湿剂的筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)分散剂的筛选本部分发明考察了几种分散剂对可湿性粉剂活菌悬浮率的影响，结果见表7，表中的对照为未加入助剂的样品。从表7可以看出，与对照相比，这9种分散剂都能提高样品的悬浮率，但是以烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐和P—萘磺酸盐縮聚物钠盐的效果最为明显。加入这两种分散剂后，白碳黑样品的悬浮率可以提高31%33%;硅藻土样品的悬浮率可以提高32.8%36%;淀粉样品的悬浮率可以提高26.3%29.6%;轻质碳酸钙的悬浮率可以提高5.42%23.1%。可见分散剂的加入能显著提高制剂的悬浮性能，在制剂活菌含量不变的情况下，解析到水中的活菌量能增加5.42%36%。这预示着在大田使用时，和对照相比，如要达到同样的防治效果，用量可以减少5.42%36%。这可明显降低使用成本，有利于产品的大面积推广。表7分散剂的筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(3)润湿剂和分散剂使用浓度的筛选对选出的润湿剂(十二烷基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐)和分散剂(烷基萘磺酸盐缩聚物钠盐和P—萘磺酸盐縮聚物钠盐)进行合适浓度的筛选。利用单因子试验和正交试验对润湿剂和分散剂的浓度进行了筛选，润湿剂的浓度的筛选以可湿性粉剂润湿时间的长短作为标准，时间越短，润湿效果越好；分散剂浓度的筛选以可湿性粉剂的悬浮率高低作为标准，悬浮率越高，效果越好。最后确定了其比较合适的浓度润湿剂为十二烷基苯磺酸钠和垸基萘磺酸盐中的l种或2种，其在可湿性粉剂中的重量百分比为0.01%10%，分散剂为烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐和P—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的1种或2种，其在可湿性粉剂中的重量百分比为0.01%10%。由实施例2和实施例3可以得出多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的载体和助剂配方为载体为白碳黑、硅藻土、淀粉和轻质碳酸钙，润湿剂为十二烷基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐中的1种或2种，分散剂为烷基萘磺酸盐缩聚物钠盐和P—萘磺酸盐縮聚物钠盐中的1种或2种，其在可湿性粉剂中的重量百分比皆为0.01%10%。实施例4多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法下面对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法进行进一步的说明，并对制备出的可湿性粉剂参照国家标准进行了各项指标的测定。干燥方式压力式喷雾、离心式喷雾。干燥条件按照实施例1所述的培养工艺获得多粘类芽孢杆菌发酵液，该多粘类芽孢杆菌发酵液不仅含有活菌(包括芽孢状态和非芽孢状态)，而且还含有活菌的代谢产物。活菌含量、含水量、芽孢率、pH、悬浮率、润湿时间以及细度的测定方法为本领域技术人员通常熟知且承认的方法。将该发酵液与实施例2和3筛选出的载体、助剂混合，得到的液固混合物通过料泵输送到喷雾塔内进行喷雾干燥，要求可湿性粉剂的水份重量百分比低于15%。结果与分析(1)压力式喷雾在压力式喷雾中，首先采用了一个条件摸索该干燥方式是否可行，其操作条件为发酵液和载体以及助剂混合后的液固混合物中的固含量为5%(重量)，喷雾干燥处理温度为190°C220°C，压力式喷雾设备的高压泵压力为13MPa。其压力式喷雾干燥结果见表8。表8通过压力式喷雾制备多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注解"对照"为无固形物的多粘类芽孢杆菌发酵液直接经过压力式喷雾设备的高压泵后得到的液体，然后测定其活菌含量。该发酵液进高压泵前活菌含量为3.5X108cfo/mL。由表8的数据可知，通过压力式喷雾设备的高压泵后的发酵液中，多粘类芽孢杆菌活菌含量只有6.5X104cfo/mL，镜检发现视野中只有少数的完整细胞，大部分菌体都已经破裂。即使在有载体(白碳黑、硅藻土、淀粉和轻质碳酸钙)吸附时，喷雾干燥后的产品中活菌含量也很低，最高才2.9Xl(^cfo/g。由此可见，由于压力式喷雾对细胞的破碎太强，因此该方法不适合多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的生产。(2)离心式喷雾利用离心式喷雾塔采用如下的操作工艺来试制多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，其操作步骤如下①开启总电源；②开启蒸汽或/和电加热系统，开启空压系统；③开启风机；④开启离心转子冷却泵，开启离心转子和气锤；当进风和出风温度达到要求后，开启料液输送泵进行喷雾。⑥结束时，按照如下顺序逐一关闭电路输料泵、加热系统、离心转子、气锤、空压、风机、冷却泵、总电源。相关的控制条件如下离心转子转速700015000r/min、进风温度100。C300。C(优选为150°C250°C，更佳为180°C220°C)、风量10008000m3/h、物料的进料速度5kg/h200kg/h(根据进料的固含量、进风温度和出风温度来调整。优选为50kg/h150kg/h，更佳为80kg/h120kg/h)、设备负压1001000Pa、气锤频率0.1lHz。表9中列出了16个批次离心式喷雾后的可湿性粉剂产品的活菌和水含量数据，由表9中数据可知，在上述离心式喷雾塔的操作工艺下，当进料的液固混合物中的固含量为5%50%时，经过离心式喷雾塔干燥后得到的可湿性粉剂的活菌含量都在107cfo/g上。由此可看出，通过离心式喷雾来制备高活菌含量的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂是成功的。表9通过离心喷雾制备多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂制备的离心式喷雾干燥工艺确定为含有非芽孢或芽孢状态活菌的多粘类芽孢杆菌发酵液和载体、助剂混合后的固含量为5%50%，喷雾干燥进风温度为10(TC30(TC，进料速度根据出风温度和可湿性粉剂的水含量来控制，为了使产品的水含量低于15%，出风温度控制在55。C15(TC左右。对得到的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，根据农药可湿性粉剂的要求进行了各项指标的测定，其结果见下表IO。表10多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的各项指标测定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>由表IO结果可知，喷雾得到的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂各项指标都符合农药可湿性粉剂的国家标准。实施例5多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对植物病害的防治自2006年以来，利用实施例4中制备的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，分别在山东、广东、海南、上海、河北、内蒙古、江西、四川、浙江、广西等地进行了防治植物细菌性和真菌性土传病害以及叶部病害的初步药效试验，结果见表U表14。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表12多粘类芽孢杆幽Bj湿性粉剂(l抑倍)防治叶商[!病害田间试验示范效果(2006年6月U月)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表13多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对大白菜软腐病的防治效果统计表(江西南昌2006年11月)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表14多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对大白菜黑腐病的防治效果统计表(江西南昌2006年11月)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由上述防治数据可知(1)多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂灌根可有效防治土传病害，如青枯病、软腐病、枯萎病、根腐病、茎基腐病、猝倒病、立枯病等植物细菌性和真菌性土传病害；(2)多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂可通过喷雾来防治细菌性和真菌性叶部病害，如角斑病、赤星病、叶斑病、斑枯病、溃疡病、穿孔病、炭疽病、灰霉病、霜霉病等；(3)可湿性粉剂浓度越高，防效越好。上述初步的试验结果表明，本发明涉及的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂有望成为可同时防治细菌性和真菌性土传及叶部病害的广谱性微生物农药。尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。权利要求1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)可湿性粉剂，它由多粘类芽孢杆菌、载体和助剂组成，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌在可湿性粉剂中的活菌含量为1×107cfu/g～1×1012cfu/g。2.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌HY96-2，其保藏号为CGMCCNo.0829;所述载体选自白碳黑、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨润土、高岭土中的一种或多种；所述助剂包括润湿剂和分散剂，其中润湿剂选自十二垸基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、丁基萘磺酸钠、烷基萘磺酸盐中的一种或多种，分散剂选自六偏磷酸钠、羟甲基纤维素钠、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸盐縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸盐縮聚物钠盐、黄原胶、卩一萘磺酸盐縮聚物钠盐中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述润湿剂为十二垸基苯磺酸钠和烷基萘磺酸盐中的1种或2种，润湿剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.01%10%;所述分散剂为烷基萘磺酸盐縮聚物钠盐和卩一萘磺酸盐缩聚物钠盐中的1种或2种，所述分散剂在可湿性粉剂中的重量百分比为0.01%10%。4.如权利要求1或2所述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的含水量小于15%(重量)，通过44um筛的比例大于95叽，悬浮率大于34%，润湿时间小于180s。5.—种制备如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将含多粘类芽孢杆菌活菌的发酵液与载体、助剂混合，得到固体重量百分比为5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的进风温度、每小时5kg200kg料的进料速度下经离心喷雾干燥，得到所述多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌活菌来自多粘类芽孢杆菌发酵液，所述发酵液含有芽孢状态的多粘类芽孢杆菌活菌、非芽孢状态的多粘类芽孢杆菌活菌、和/或所述多粘类芽孢杆菌的代谢产物。7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌的芽孢率高于10%。8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌是通过以下方法培养获得的在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中，在通气量控制在气液比为0,2:12:1、转速在100r/min或以上，培养所述多粘类芽孢杆菌24小时以上，发酵结束时的培养基pH控制在7.09.0,其中所述碳源选自葡萄糖、淀粉或/和大米粉，所述氮源选自蛋白粉、酵母粉、花生饼粉或/和大豆粉，所述无机盐包含0.005%0.01%的Mn2+。9.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂在防治植物细菌性和真菌性土传病害及叶部病害中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物细菌性和真菌性土传病害或叶部病害选自青枯病、枯萎病、软腐病、根腐病、茎基腐病、猝倒病、立枯病、赤星病、角斑病、叶斑病、斑枯病、溃疡病、穿孔病、炭疽病、灰霉病或霜霉病。全文摘要本发明涉及一种多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用，该可湿性粉剂由载体、助剂和多粘类芽孢杆菌发酵液混合后经离心喷雾干燥而得到。本发明的多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂可单独或与其它药剂复配，通过灌根来防治植物细菌性和真菌性土传病害，以及通过喷雾来防治细菌性和真菌性叶部病害。文档编号A01N25/14GK101243801SQ20071003880公开日2008年8月20日申请日期2007年3月30日优先权日2007年3月30日发明者蜀李,李元广,李淑兰,李际军,汪荣津,沈国敏,伟王,盛保伟,陈智旺,魏鸿刚申请人:上海泽元海洋生物技术有限公司