专利名称：用于在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱的来自解脂耶氏酵母的dgat基因的制作方法
技术领域：
本发明 属于生物技术领域，尤其涉及编码二酰基甘油酰基转移酶基因的多核苷酸 序列以及利用此类酰基转移酶在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱。
背景技术：
植物油脂在工业上和营养学方面具有多种用途，并且对植物膜功能的实现和气候 适应性起着重要作用。这些油脂表现出大量的化学结构，这些结构决定着上述油脂的生理 学和工业特性。大量的上述结构直接或间接地产生自令上述油脂的不饱和度改变的代谢过 程。不同植物的不同代谢模式产生出这些改变的油脂，而要大量、经济地生产所期望的油 月旨，则通常需要对外来植物物种进行驯化或者对已适应的农作物加以改良。利用诱变方式来改变脂肪酸的组成和含量存在严重的局限性。筛选法很难发现以 下情形的突变a)导致显性(功能获得性)表型，b)位于植物生长所必需的基因中，以及 c)位于非限速酶和由一种以上基因编码的酶的编码基因中。在获得了具有所期望表型的突 变玉米品系的实例中，由于所期望的油脂成分很可能是若干隐性基因的产物，通过传统育 种技术对原种品系进行的基因渗入既耗时又昂贵。近来的分子和细胞生物学技术提供了克服诱变方法的某些局限的潜在可能，包 括能满足大范围育种的需要。一些特别有用的技术包括在转基因植物中对外来基因进行 种子特异性的表达(参见Goldberg等人(1989)Cell 56 149-160)，以及利用反义RNA以 显性或组织特异性方式对植物靶基因进行抑制(参见van der Krol等人(1988) Gene72 45-50)。其他进展包括向工业油料作物的商品化品种原种中转入外来基因，例如大豆 (Chee 等人(1989) Plant Physiol. 91 1212-1218 ；Christou 等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 7500-7504 ；Hinchee 等人(1988) Bio/Technology 6 :915_922 ；欧洲专利公 布 0 301749 A2)，卡诺拉(De Block 等人(1989) Plant Physiol. 91 :694_701)，和向日葵 (Everett等人(1987)Bio/Technology 5 1201-1204)，以及在育种程序中利用一些基因作 为限制性片段长度多态性(RFLP)标记，从而令隐性性状向原种品系的基因渗入既快速又 花费较少(Tanksley等人(1989)Bio/Technology 7:257-264)。然而，上述各种技术的应 用，需要对具有重要商业意义的基因进行鉴定和分离。大多数的游离脂肪酸被酯化为辅酶A (CoA)，以产生酰基辅酶A。然后这些分子在 细胞内质网内作为甘油脂类合成的底物，产生磷脂酸和二酰甘油(DAG)。这些代谢中间产物 中任何一种都可被用于形成膜磷脂(例如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)，或者 DAG可被用于形成三酰基甘油(TAG)，后者是真核细胞中所储存的类脂类主要储备物。在植物、真菌和哺乳动物中，二酰基甘油酰基转移酶(“DGAT”)是一种在三酰基甘油生成反应中催化最后一个酶促步骤的整合膜蛋白。该酶负责将一个酰基基团从酰基-辅酶A上转移到1，2_ 二酰基甘油(“DAG”)的sn-3位上，以形成三酰基甘油(“TAG”)。在 植物和真菌中，DGAT与膜和脂质体片段相联，尤其在油料种子中，其参与组成用作能量储备 的碳贮藏库。TAG被认为是细胞中用于储存能量的一种重要化学物质。已知DGAT可调控 TAG的结构并指导TAG的合成。此外，已知DGAT反应为油脂合成所特有。在植物中，TAG是植物油的基本成分，种子将其作为供萌芽期使用的能量的一种贮 藏形式。已鉴定出的DGAT蛋白包括两个不同的家族。DGAT蛋白的第一个家族(“DGAT1”)与 酰基辅酶A 胆固醇酰基转移酶(“ACAT”)相关，描述于美国专利6，100, 077和6，344，548。 DGAT蛋白的第二个家族(“DGAT2”)与上述DGATl家族不相关，描述于2004年2月5日公 布的PCT专利公布WO 2004/011671。关于DGAT基因及其在植物中的使用的其他参考文献 包括 PCT 专利公布 W02004/011, 67UW01998/055, 631 和 W02000/001, 713，以及美国专利公 布 20030115632。申请人:之受让人的已公布的共同待决专利申请US 2006-0094088描述了植物和 真菌中的DGAT基因，并且描述了它们的用途是在食用油中调节多不饱和脂肪酸(“PUFA”) 的水平。申请人:之受让人的已公布的国际专利申请WO 2005/003322描述了对用于改变含 油酵母中PUFA和油脂含量的磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶以及DGAT2的克隆。发明概述本发明涉及一种转基因大豆种子，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量与非转基 因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10%。在第二种实施方案中，本发明涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量的方法，所 述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量 相比高出至少10%的步骤(a)中的转化的大豆细胞。在第三种实施方案中，本发明涉及转基因玉米谷粒，所述转基因玉米谷粒的总脂 肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10%。在第四种实施方案中，本发明涉及提高玉米谷粒的总脂肪酸含量的方法，所述方 法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个玉米谷粒；(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量 相比高出至少10%的步骤(a)中的转化的玉米谷粒。在第五种实施方案中，本发明涉及转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离 子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10%并且油酸 含量高出至少25%。在另一个实施方案中，本发明涉及转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离 子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10%，并且具 有至少一种下列特征i)油酸含量高出至少25% ;ii)亚麻酸含量降低至少25% ;iii)亚油酸含量降低至少4% ；iv)棕榈酸含量降低至少8% ；以及ν)硬脂酸含量高出至少14%。在第六种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量的方 法，所述方法包括
(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总 脂肪酸含量和油酸含量相比分别高出至少10%和至少25%的步骤(a)中的转化的大豆细 胞。在第七种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚麻酸 含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和亚麻酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的 总脂肪酸含量和亚麻酸含量相比分别高出至少10%和降低至少25%的步骤(a)中的转化 的大豆细胞。在第八种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚油酸 含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和亚油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的 总脂肪酸含量和亚油酸含量相比分别高出至少10%和降低至少4%的步骤(a)中的转化的 大豆细胞。在第九种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其棕榈酸 含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和棕榈酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的 总脂肪酸含量和棕榈酸含量相比分别高出至少10%和降低至少8%的步骤(a)中的转化的 大豆细胞。在第十种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量的 方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和硬脂酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的 总脂肪酸含量和硬脂酸含量相比分别高出至少10%和至少14%的步骤(a)中的转化的大 豆细胞。本发明的任何一种转基因种子可以包含具有至少一种DGAT序列的重组构建体， 所述DGAT序列可以选自DGAT1、DGAT2和DGATl与DGAT2的组合。此外，所述DGAT序列可 以是一种耶氏酵母的序列。从本发明的转基因大豆种子获得的产品和/或副产品同样属于本发明的范围。耶氏酵母DGAT基因保持了其功能的突变型也同样属于本发明的范围。特定的例 子包括但不限于一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有二酰基甘油酰基转移酶 活性的多肽的序列，其中所述多肽如SEQ ID:83、88或93所示。所述核苷酸序列的互补序 列，包含所述核苷酸序列的重组DNA构建体，以及掺入了所述重组DNA构建体的细胞也同样属于本发明的范围。产生油料种子的植物适用于包含所述重组构建体。附图
和序列表的简要说明根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的详 细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。图 1 显示了 pFBAIn-YLDGATl、pFBAIn-YLDGAT2 和 pFBAIn-MODl 的质粒图谱。图2显示了 KS352和KS332的质粒图谱。
图3显示了 KS349、KS362和KS364的质粒图谱。图4显示了携带KS349的体细胞胚油酸含量和总酯化脂肪酸含量之间的强相关性 (R2 ^ 0. 59)。图5显示了单独携带KS362或同时携带KS362与KS349和KS364其中之一的体细 胞胚油酸含量和总酯化脂肪酸含量之间的强相关性(R2 ^ 0. 67)。图6显示了通过共转化质粒KS349和KS362得到的转基因大豆种子(Tl世代)油 酸含量和油脂含量之间的相关性(R2 ^ 0. 45)。图7显示了通过共转化质粒KS349和KS362 (A)和单独转化质粒KS362 (B)得到的 Tl种子的油脂含量和种子重量。图8显示了来自基因组DNA印迹的杂交结果。基因组DNA分离自来自事件 AFS4818. 1. 2、AFS4818. 1. 3、AFS4818. 1. 5、AFS48182. 6 和 AFS4818. 1. 9 (参见实施例 6)的 转基因大豆。用限制酶EcoRI或HindIII消化DNA，然后在一块凝胶上跑出并与尼龙滤膜杂 交(泳道 1 和 2 为 AFS4818. 1. 2，泳道 3 和 4 为 AFS4818. 1. 3，泳道 5 和 6 为 AFS4818. 1. 5， 泳道7和8为AFS48182. 6，泳道9禾口 10为AFS4818. 1. 9，泳道11禾Π 12为同样用EcoRI禾口 HindIII消化后的非转基因的野生型DNA)。上方的印迹(A)所用的杂交探针为一种耶氏酵 母DGATl特异性探针，下方的印迹所用的则为一种耶氏酵母DGAT2特异性探针。图9显示了来自基因组DNA印迹的杂交结果。图中的印迹与图8中所描述的相似， 不同之处在于DNA全部用限制酶BstXI消化并且印迹利用一种耶氏酵母DGAT2特异性探针 进行探测。序列描述概要说明了后附的序列列表。此序列列表中以单个字母表示核苷 酸，以单独的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Researchl3 3021-3030 (1985)和 Biochemical Journal 219(2) :345_373 (1984)所描述的 IUPAC-IUB 标准中所规定的。核酸和蛋白质SEQ ID Number摘要
权利要求
转基因大豆种子，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％。
2.权利要求1的转基因大豆种子，其中所述种子包含具有至少一种DGAT序列的重组构 建体。
3.权利要求2的转基因大豆种子，其中所述DGAT序列选自DGATl、DGAT2和DGATl与 DGAT2的组合。
4.权利要求2或3的转基因大豆种子，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
5.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比 高出至少10%的步骤(a)中的一个或多个转化的大豆细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述DGAT序列选自DGATl、DGAT2和DGATl与DGAT2的组口 O
7.权利要求5或6的方法，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
8.转基因玉米谷粒，所述转基因玉米谷粒的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分 离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10%。
9.权利要求8的转基因玉米谷粒，其中所述谷粒包含具有至少一种DGAT序列的重组构 建体。
10.权利要求9的转基因玉米谷粒，其中所述DGAT序列选自DGATl、DGAT2和DGATl与 DGAT2的组合。
11.权利要求8或9的转基因玉米谷粒，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
12.用于提高玉米谷粒的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个玉米谷粒；(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比 高出至少10%的步骤(a)中的一个或多个转化的玉米谷粒。
13.权利要求12的方法，其中所述DGAT序列选自DGATl、DGAT2和DGATl与DGAT2的 组合。
14.权利要求12或13的方法，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
15.转基因大豆种子，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量与非转基因的、 无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量相比分别高出至少10%和高出至少 25%。
16.权利要求15的转基因大豆种子，其中所述种子包含具有至少一种DGAT序列的重组 构建体。
17.权利要求16的转基因大豆种子，其中所述DGAT序列选自DGATl、DGAT2和DGATl与 DGAT2的组合。
18.权利要求16或17的转基因大豆种子，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
19.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量相比分别高出至少10%和高出至少25%的步骤(a)中的一个或多个转 化的大豆细胞。
20.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚麻酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和亚麻酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂 肪酸含量和亚麻酸含量相比分别高出至少10%和降低至少25%的上述步骤(a)中的一个 或多个转化的大豆细胞。
21.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚油酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和亚油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂 肪酸含量和亚油酸含量相比分别高出至少10%和降低至少4%的步骤(a)中的一个或多个 转化的大豆细胞。
22.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其棕榈酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和棕榈酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂 肪酸含量和棕榈酸含量相比分别高出至少10%和降低至少8%的上述步骤(a)中的一个或 多个转化的大豆细胞。
23.用于提高大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量的方法，所述方法包括(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；(b)选择总脂肪酸含量和硬脂酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂 肪酸含量和硬脂酸含量相比分别高出至少10%和高出至少14%的步骤(a)中的一个或多 个转化的大豆细胞。
24.权利要求19至23的方法，其中所述DGAT序列选自DGAT1、DGAT2和DGATl与DGAT2的组合。
25.权利要求19至23的方法，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
26.权利要求24的方法，其中所述DGAT序列为耶氏酵母序列。
27.由权利要求19至23的方法生产的转基因大豆。
28.由权利要求24的方法生产的转基因大豆。
29.由权利要求25的方法生产的转基因大豆。
30.由权利要求26的方法生产的转基因大豆。
31.从权利要求27的转基因大豆获得的产品和
32.从权利要求28的转基因大豆获得的产品和
33.从权利要求29的转基因大豆获得的产品和
34.从权利要求30的转基因大豆获得的产品和
35.分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括(a)编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽如SEQ ID :83、88 或 93 所示；(b)(a)中的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列与所述核苷酸序列由相同数目 的核苷酸组成并且100%互补。/或副产品。 /或副产品。 /或副产品。 /或副产品。
36.包含权利要求35的分离的核酸片段的重组DNA构建体，其中所述分离的核酸片段 与至少一种调控序列可操作地连接。
37.在其基因组中包含权利要求36的重组DNA构建体的细胞。
38.权利要求37的细胞，其中所述细胞为油料种子植物细胞。
39.在其基因组中包含权利要求37的重组构建体的转基因油料种子。
40.权利要求39的油料种子，其中所述油料种子选自大豆、玉米、卡诺拉、向日葵、亚 麻、棉花和红花。
41.用于提高油料种子的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括(a)用权利要求37的重组构建体转化至少一个油料种子细胞；(b)选择总脂肪酸含量高于非转基因的、无转基因分离子油料种子的总脂肪酸含量的 步骤(a)中的一个或多个转化的油料种子细胞。
42.权利要求41的方法，其中所述油料种子选自大豆、玉米、卡诺拉、向日葵、亚麻、棉 花和红花。
全文摘要
本文描述了总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％的转基因大豆种子。来自解脂耶氏酵母的DGAT基因被用于实现种子贮藏油脂的提高。
文档编号A01H5/00GK101939434SQ200880017143
公开日2011年1月5日 申请日期2008年5月23日 优先权日2007年5月24日
发明者H·G·达穆德, K·迈尔, N·S·亚达夫, W·D·希茨 申请人:纳幕尔杜邦公司