专利名称：一种大豆种子特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的序列及其应用。
背景技术：
大豆是我国重要的经济作物，籽粒中含有丰富的蛋白质、脂类和多种营养元素， 磷、铁、钙矿质比其他作物高几十倍，并含有多种维生素，特别是大豆中含有人体不能合成 的8种必需氨基酸，是其他谷类作物不能比拟的。大豆不仅是人类蛋白和脂类的主要来源， 医疗保健作用非常明显。因此，以大豆种子作为生物反应器，利用植物基因工程方法，在转 基因大豆种子中产生具有工业用途及药用价值的大豆新品种已成为人们研究的热点。在转基因大豆中增加或降低某些物质含量，实现外源目的基因在转基因大豆中正 常、有效表达，首要考虑的问题是选择适合的植物启动子。目前在植物表达载体中广泛应用 的是组成型启动子，在该类启动子的调控下，外源基因在转基因植物的所有部位和发育阶 段都会表达，造成植物营养不必要的浪费，有时还会影响到植物的正常生长发育。种子特异 性启动子能够调控外源基因在种子中特异性表达，使所表达的外源蛋白都集中在种子中， 因此，种子特异性启动子是大豆品质改良工程中必不可少的有利工具。目前，已克隆获得的 种子特异性启动子主要来自于粮食作物及油料作物种子中的蛋白、氨基酸、淀粉、脂类等合 成代谢途径中相关的酶基因的启动子。一些种子特异性启动子在应用中显现出了极显著的 效果，如玉米胚乳特异启动子驱动小麦基因在玉米中表达，降低了籽粒的硬度，有利于玉米 的湿磨及家畜饲喂；水稻中OlelS基因启动子驱动RINOl基因在种子中特异表达，降低了水 稻籽粒中植酸含量；napin基因启动子参与的自我剪切载体在油菜种子中特异表达，应用 于建立无标记的安全转基因植物等。在大豆基因工程研究利用中，可以使用来自近缘的其他植物的种子特异性启动 子，但是有时种子特异性启动子在非本植物中表达时易出现非种子特异表达，如蚕豆USP 基因启动子可以驱动报告基因在转基因拟南芥种子中特异性表达，但该启动子驱动报告基 因在转基因豌豆的花药、花粉和种皮中都表达；有时种子特异表达的强度也可能会发生改 变。如棉花的α-球蛋白启动子在转基因拟南芥和烟草中驱动GUS的表达活性只是棉花 中16. 7%和1%，说明在大豆转基因研究中，利用大豆本身的种子特异性启动子是十分必 要的。大豆中已克隆的种子特异性启动子并在转基因研究中得到应用的主要有伴大豆 球蛋白、球蛋白和油质蛋白的启动子，与其他粮食作物相比数量较少。可能是由于专利保 护的原因，一些大豆种子特异性启动子不能被利用；水稻的谷蛋白，醇溶蛋白、玉米醇溶蛋 白启动子是种子特异性启动子，但大豆不属于谷类作物，所以在大豆中不存在谷蛋白和醇 溶蛋白这两种蛋白基因的启动子；与淀粉合成有关的种子特异启动子有小麦的淀粉粒结合 淀粉合成酶和水稻的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的启动子，但大豆种子中碳的贮藏主要与三 酰基甘油有关，而不是淀粉，大豆中与淀粉合成有关的种子特异表达基因可能相对较少。因此，获得一种新的大豆种子特异性启动子，对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。
发明内容
本发明提供一种大豆种子特异性启动子，以解决目前缺少大豆种子特异性启动子 的问题。本发明采取的技术方案是一种大豆种子特异性启动子，其核苷酸序列如Sequence NO. 1所述。本发明所述的大豆种子特异性启动子的制备方法，包括下列步骤a. soyAPl基因上游远端序列的克隆利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物SPl :5，-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3，SP2 :5’ -GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’SP3 :5’ -CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’与随机兼并引物AD4 :5，-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3，，进行三次 PCR 反 应，获得865bp的上游远端序列；b、对soyAPl基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2， soyAPl-p 和 SAP4 ；C.利用 Y3 :5，-GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3‘禾口Y5 :5，GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT-3‘这对引物扩增 soyAPl-p 片段；d.将soyAPl-p扩增片段与克隆载体pMDIS-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。本发明所述的大豆种子特异性启动子在作为大豆种子特异性启动子中的应用。天冬氨酸蛋白酶(APs)是各种植物中广泛存在的一种酶，一些APs在各种组织中 普遍表达，如大麦AP在根、茎、叶、花中表达；一些APs具有组织特异性，只存在于干种子和 豆荚中，或只在花和豆荚中等等。大豆中有两个天冬氨酸蛋白酶基因soyAPl和soyAP2，其 中soyAPl基因在种子中，尤其在干种子中表达。本发明通过对soyAPl基因上游1650bp的 序列(命名为SAP1)进行缺失分析，发现长度为1255bp的片段(命名为soyAPl-p)，其核苷 酸序列如SequenceNO. 1所述，在大豆各组织中进行瞬时表达时表现出种子特异性，且启动 下游基因在种子中的表达能力与CaMV35S组成型启动子相近，明确soyAPl-p启动子是种子 特异性启动子。所述soyAPl-p启动子序列中含有多种与种子特异表达相关的顺式作用元件，参 见图7 对种子特异性基因高水平表达十分重要的RY-repeat，常出现在参与三酰基甘油合 成和植物种子特异表达基因启动子中的E-box，增强转录的顺式元件CAAT，胚乳表达顺式 作用元件Skn-Imotif，胚表达顺式作用元件SEF3、SEF4、种子特异元件AACA、ACGT0此外，soyAPl-p启动子序列中还含有与光应答有关的顺式作用元件 GTl (GRffAAff) 7个；2个ff-box (TGACY)是WRKY转录因子的结合位点；1个CNGTTR基序是MYB 转录因子的结合位点；8个AAAG核心序列是DOF转录因子的结合位点。本发明所述的soyAPl-p启动子具有明显启动子特性，与现已知启动子无同源性，通过瞬时表达证明其能驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动 子。本发明的有益效果是本发明中克隆了大豆的soyAPl-p启动子，研究该启动子在大豆中的组织表达特性及表达效率，为其有效应用提供依据；该启动子的获得为大豆转基 因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。
图1是TAIL-PCR扩增soyAPl基因上游远端SAPl_b片段的电泳图；图2是soyAPl基因上游远端SAPl_b片段与T载体连接的重组质粒酶切鉴定；图3是SAPl片段及其缺失片段的PCR扩增电泳图；图4是SAPl片段及其缺失片段与T载体连接后的酶切鉴定；图5是SAPl片段及其缺失片段与表达载体连接后的酶切鉴定；图6是各表达载体转化农杆菌的PCR鉴定；图7是soyAPl-p启动子的序列分析；图8是SAPl片段及其缺失片段的荧光定量检测结果；图9是⑶S组织化学染色观察结果，A 根；B 茎；C 叶；D 种子a 未侵染的大豆； b :GUS基因由CaMV35S组成型启动子驱动；c :GUS基因由SAPl启动子驱动；d :GUS基因由 soyAPl-ρ启动子驱动。
具体实施例方式实施例1 soyAPl基因上游远端片段SAPl_b的克隆及SAPl的序列分析1、引物的设计与合成根据大豆基因组中soyAPl基因ATG上游的一段785bp已知序列，其核苷酸序列如 Sequence NO. 2所述，简称SAPl_a，设计合成3个嵌套引物SPl SP3 ；参照论文《大豆种 子特异性启动子的克隆及序列分析》(财音青格乐，李明春，蔡易.作物学报，2005，31(1) 11—17)禾口〈〈Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrateresuctase gene from Chlorella ellipsoidea》 (Peng Wang, Yongru Sun, Xia Li. Journal of AppliedPhycology, 2004,16 11-16.)中所述的 TAIL-PCR 方法，合成随机 兼并引物ADl AD4 SPl :5，-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3，SP2 :5’ -GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’SP3 :5’ -CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’
AD1 5，-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3，AD2 5，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3，AD3 5，- (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3，AD4 5，-AG (A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG—3，2、TAIL-PCR方法扩增未知序列A.采用CTAB法提取，从吉豆2号大豆品种叶片中提取基因组DNA，并进行纯化。B. TAIL-PCR 方法扩增
a. 1st PCR 反应以大豆基因组DNA作为模板，当以AD4primer作为上游引物时扩增出未知序列， SPlprimer为下游引物，进行1st PCR反应。扩增反应体系Template (基因组 DNA) 0. 5ul
dNTP MixturedOmM each) Iul10 X LAPCR Buffer (Mg+plus) 2. 5ulLATaq (5U/ul) 0. 3ulAD4primer (IOOuM) 0. 5ulSPlprimer(IOuM) IuldH20 up to 25ul扩增反应条件92C 3min95 °C Imin
<formula>formula see original document page 6</formula>94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min<formula>formula see original document page 6</formula>
72 °C IOminb. 2nd PCR 反应取Iul 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AD4 primer作为上游引物， SP2 primer为下游引物，进行2nd PCR反应。扩增反应体系Templatedst PCR 反应液) IuldNTP MixturedOmM each) 2ul10 X LAPCR Buffer (Mg+plus) 5ulLATaq (5U/ul) 0. 5ulAD4 primer (IOOuM) IulSP2 primer (IOuM) 2uldH20 up to 50ul扩增反应条件<formula>formula see original document page 6</formula>
72 °C IOminc. 3rd PCR 反应取Iul 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AD4primer作为上游引物，SP3primer为下游引物，进行3rd PCR反应。扩增反应体系Template (2nd PCR 反应液) IuldNTP MixturedOmM each) 2ul10 X LAPCR Buffer (Mg+plus) 5ulLATaq (5U/ul) 0. 5ulAD4 primer (IOOuM) IulSP3 primer (IOuM) 2uldH20 up to 50ul扩增反应条件
94°C 30s, 64°C 1 min, 72°C 2 min "
94°C 30s, 64°C 1 min, 72°C 2 min 15 Cycles
94°C 30s, 440C 1 min, 72。C 2 min .72 °C IOmin得到的指数扩增产物，在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测。图1所示，M为 DL2000marker, 1为二次PCR扩增结果，2为三次PCR扩增结果，扩增出的片段长度在 750bp-1000bp之间，与pMD18-T克隆载体连接后进行酶切鉴定，如图2所示M :2000bp DNA Marker ； 1,2 =Hind III和XbaI双酶切，测序后可知长度为911bp，该片段3 ‘端有46bp的 序列与soyAPl基因ATG上游近端的785bp已知序列相同，其余865bp为上游远端序列，简 称SAPl-b，其核苷酸序列如Sequence NO. 3所述。本实施例中采用TAIL-PCR方法扩增未知序列。该方法通过3个嵌套的特异性引物 分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段。 该方法操作简便，成本较低，特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段。实施例2 =SAPl片段及其5’端缺失片段的克隆SAPl的序列分析soyAPl基因ATG上游近端785bp的已知序列SAPl_a，和扩增的865bp上游远端 序列 SAPl-b，共 1650bp，命名为 SAP1。在线软件 Neural Network Promote Prediction 对 大豆SAP1，其核苷酸序列如Sequence NO. 4所述，进行基础启动子预测，在195bp_245bp， 499bp-549bp，771bp-821bp，871bp-921bp，1042bp-1092bp 和 1144bp_1194bp 的位置存在基 础启动子序列，可能性分别是0. 82,0. 78,0. 52,0. 62,0. 77和0. 75，前两个基础启动子区预 测值较高。根据真核细胞基因启动子的基本特征，推测可能的转录起始位点在553bp处的 A0对SAPl序列进行分析后，设计该片段及其5’端缺失片段序列的PCR引物上游引 物Yl，Y2，Y3，Y4，下游引物Y5 (引物序列如下)，扩增后的片段分别为SAPl (-552 +1098)， SAP2 (-356 +1098)，soyAPl-ρ (-157 +1098)和 SAP4 (-34 +1098)。
Yl :5，-AGTGGAGTAGCAAAGGACGAGAGGTA-3，Y2 :5，-GGGCTGCAGTCACCCTGCAAAAAAG-3’ (加横线者为 PstI 酶切位点)Y3 5' -GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3‘(加横线者为 PstI 酶切位点)Y4 :5，-GGGCTGCAGAAATGAAGGTGTAACTG-3’ (加横线者为 PstI 酶切位点)Y5 :5，-GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT-3‘(加横线者为 NcoI 酶切位点)；PCR扩增反应体系为Template (基因组 DNA) 0. 5uldNTP MixturedOmM each) 0. 5ul10XExPCR Buffer (Mg+plus) :2· 5ulExTaq (5U/ul) 0. 3ulY1/Y2/Y3/Y4 (IOuM) IulY5 (IOuM) IuldH20 up to 25ul扩增反应条件94 °C 5min
94 °C 30s ι
59。C 40s · 3 OCycles
72 0C 1 min -72 °C IOmin将上述序列的扩增产物在的琼脂糖凝胶上电泳检测；如图3所示，M为 DL2000marker，1、2、3、4 分别为 SAP1、SAP2、soyAPl-p、SAP4 的扩增结果。将这 4 个片 段分别与PMD18-T克隆载体连接，分别获得重组质粒pMD18-T-SAPl、pMD18_T_SAP2、 pMD18-T-soyAPl-p和pMD18_T_SAP4，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对4个重组质粒用PstI 单酶切和PstI、NcoI双酶切进行鉴定，结果图4所示，M :2000bp DNA Marker ;1、2、3、4分 别为 PstI 和 NcoI 双酶切重组质粒 pMD18-T-SAPl、pMD18_T_SAP2、pMD18-T_soyAPl-p 禾口 PMD18-T-SAP4，表明4个片段已完全插入pMD18_T载体中。将4个重组质粒进行测序，验证 正确。实施例3 瞬时表达载体的构建及农杆菌介导法侵染大豆根、茎、叶、种子将pMD18-T-SAPl、pMD18_T_SAP2、pMD18-T_soyAPl-p、pMD18_T_SAP4 质粒载体和 PCAMBIA1301载体分别用PstI和NcoI进行双酶切，将酶切前4个质粒载体得到的小片段 分别与酶切PCAMBIA1301载体得到的大片段连接，分别得到SAP1、SAP2、soyAPl-p、SAP4与 GUS 基因融合的表达载体 pCAM-SAPl、pCAM_SAP2、pCAM-soyAPl-p 和 pCAM_SAP4。同样用 PstI和NcoI两个酶对这4个载体质粒进行酶切鉴定，结果图5所示，M :2000bp DNAMarker ； 1、2、3、4 分别为 PstI 和 NcoI 双酶切表达载体 pCAM-SAPl、pCAM_SAP2、pCAM-soyAPl-p 禾口 PCAM-SAP4,证明 pCAM-SAPl、pCAM-SAP2、pCAM-soyAPl-p 和 pCAM_SAP4 表达载体构建正确。通过冻融法，将pCAM-SAPl、pCAM_SAP2、pCAM-soyAPl-p 和 pCAM_SAP4 载体质粒转 化农杆菌EHA105，菌液PCR对其进行验证，图6所示，M :2000bp DNA Marker ；1、2、3、4 分别 为表达载体pCAM-SAPl、pCAM-SAP2、pCAM-soyAPl-p和pCAM_SAP4的农杆菌菌液PCR扩增产物，证实各载体转入农杆菌。参照古月新文〈〈Embryo and anther regulation of the mabinlin II sweet protein gene in CapparismasaikaiLevl)) (Xin-ffen Hu, Si-Xin Liu, Jian-Chun Guo. Funct Integr Genomics, 2009,9 351-361)的方法，农杆菌介导法转化大豆根、茎、叶、 种子。将大豆幼苗的根、茎剪成小块，取幼嫩叶片，种子去种皮后切成两瓣，浸没在分别 含有 pCAM-SAPl、pCAM-SAP2、pCAM-soyAPl-p、pCAM_SAP4 质粒和含有 CaMV35S 启动子的 PCAMBIA1301载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液中(菌体重悬后OD6tltl约为0. 2)，真空压力 0.09-0. lMPa，15分钟。侵染后，在16h光照、8h小时黑暗光周期、22°C条件下，共培养Id。实施例4:荧光定量检测荧光定量检测参照《植物基因工程原理和技术第二版》(王关林，方宏筠著，北京科学出片反社，2002)和《Assaying chimeric genes in plants :The GUS gene fusion system》(JeffersonJefferson R A.Plant Molecular Biology Reporter，1987，5 (4) 387-405)的方法进行。取未侵染和侵染各表达载体的大豆种子约lOOmg，分别放入研钵 中，用液氮研磨成粉末，加入600ul提取缓冲液，离心后的上清液为GUS蛋白粗提液。样 品粗提液分为两部分，一部分采用Bradford法测定GUS蛋白含量；另一部分用于荧光定 量检测，粗提液中加2mmol L-1的GUS反应底物4-MUG，37°C保温15min后，加0. 2mmol L-1 Na2CO3反应终止液终止反应，在激发波长365nm，发射波长455nm下，测定荧光值。⑶S活 性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果如图8显示，侵染 pCAM-SAPl、pCAM-soyAPl-p和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301质粒载体的大豆种子 的⑶S荧光值相近，说明SAPl片段和soyAPl-p启动子驱动下游基因在种子中表达的能力 与CaMV35S启动子相近的；侵染pCAM_SAP2质粒载体的种子的荧光值明显较pCAM-SAPl和 pCAM-soyAPl-p质粒载体的种子的荧光值低，在SAPl序列的-552 -356之间可能存在影 响种子表达的负调控元件。实施例5 瞬时表达的显微观察对启动下游基因在种子中表达较高的含有SAPl和soyAPl-p序列的表达载体侵染 的大豆各组织进行⑶S组织化学染色，同样参照王关林和Jefferson的方法进行。取出部分 未侵染和侵染分别含有pCAM-SAPl、pCAM-soyAPl-p和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301 质粒载体的大豆根、茎、叶、种子，放入⑶S染色液中，该⑶S染色液包括50mmol Γ1磷酸 钠缓冲液 ρΗ 7. 0, IOmmol L^1EDTA, lmmol L-1X-GIucjO. 1% TritonX-100, IOmmol L-1 巯基 乙醇，37°C温育过夜，75%乙醇脱色，10倍显微镜下观察染色情况，参见图9。与未侵染的 大豆种子、根、茎、叶相比，转化PCAMBIA1301表达载体的大豆种子、根、茎、叶被X-Gluc溶 液染成蓝色，说明该载体中的⑶S报告基因能够被CaMV35S组成型启动子激活表达。转化 pCAM-SAPl载体的大豆根基本没有被染色，茎和叶显现较浅的蓝色，种子染色相对较深 ’转 化pCAM-soyAPl-p载体的大豆根、茎、叶的颜色与未侵染的大豆根、茎、叶差不多，种子染色 相对较深；说明soyAPl-p启动子序列具有种子特异表达特性，以上的实验证明soyAPl-p启 动子序列能够驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动子。实施例1至实施例4中pCAMBIA-1301其核苷酸序列如Sequence NO. 5所述，限制 性内切酶 HindIII、XbaI、PstI、NcoI、pMD18_T 克隆载体、ExTaq, T4 连接酶均购自 Takara 公司，DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁公司，5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)购自Clontech公司，4-MU和4-MUG购自Sigma公司，大肠杆菌DH 5 α感受态购自北京鼎国生物 技术公司，PCR引物和DNA序列测定由上海生工生物工程公司合成，其他试剂均为进口或国 产分析纯。实施例1至实施例4中，实验所用的主要仪器，PCR扩增仪(Bio-Rad Peltier ThermalCycler)，电泳仪(Bio_Rad3000xi)；高速冷冻离心机(Sigma 2K-15)；凝胶成相分 析仪(英国UVItec公司)；6010紫外可见光光度计(安捷伦上海分析仪器有限公司)。实施例1至实施例4中，采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、转化等基因工程操作方 法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出 版)和《植物基因工程原理和技术第二版》中( 王关林，方宏筠著，北京科学出版社，2002)。
权利要求
一种大豆种子特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列如Sequence NO.1所述。
2.如权利要求1所述的大豆种子特异性启动子的制备方法，其特征在于包括下列步骤a.soyAPl基因上游远端序列的克隆 利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物 SPl :5’ -GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3’ SP2 5' -GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3' SP3 5' -CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3'与随机兼并引物 AD4 :5，-AG (A/T) GNAG (A/T) ANCA (A/T) AGG-3，，进行三次 PCR 反应，获 得865bp的上游远端序列；b.对soyAPl基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAPl-p 和 SAP4 ；c.利用Y3 :5’ -GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3’ 禾PY5 :5，-GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT -3，这对引物扩增 soyAPl-ρ 片段；d.将soyAPl-p扩增片段与克隆载体pMD18_T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。
3.如权利要求1所述的大豆种子特异性启动子在作为大豆种子特异性启动子中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大豆种子特异性启动子，属于大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的序列及其应用。其核苷酸序列如Sequence NO.1所述；制备方法包括下列步骤soyAP1基因上游远端序列的克隆，对soyAP1基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAP1-p和SAP4；利用引物扩增soyAP1-p片段，将soyAP1-p扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。本发明中克隆了大豆的soyAP1-p启动子，在大豆种子中特异性表达；该启动子的获得为大豆转基因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。
文档编号C12N15/10GK101818151SQ20101013255
公开日2010年9月1日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者张庆林, 李景文, 潘肃, 王庆钰, 王洪预, 王英, 程浩, 赵艳, 钱丹丹 申请人:吉林大学