专利名称：：一种棉花育种方法
技术领域：
：本发明涉及作物育种领域，尤其涉及一种棉花育种方法。
背景技术：
：作物育种的基本过程是创造变异_变异后代的选择_优良基因型的确定_鉴定和繁殖这几个步骤，就整个过程来讲，最基本的是首先要创造变异。基于不同的创造变异方法，目前的育种方法可以归纳为以下几种①诱变育种，指利用人工诱变(物理诱变或化学诱变)的方法获得生物新品种的育种方法，优点能提高变异频率，变异范围广，缺点有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制；②杂交育种，指利用具有不同基因组(同种)的生物个体进行杂交，造成基因重组；③单倍体育种，利用花药离体培养技术获得单倍体植株，再诱导其染色体加倍，从而获得所需要的纯系植株的育种方法；④多倍体育种，主要利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，造成染色体加倍；⑤细胞工程育种，是指用细胞融合的方法获得杂种细胞，利用细胞的全能性，用组织培养的方法培育杂种植株的方法；⑥基因工程育种，将外源基因通过转基因的方法整合到植物基因组的方法。上述的6种方法均有自己的优点和缺点。单倍体育种、多倍体育种、细胞育种和基因工程育种过程中的一个重要步骤是组织培养，就是选择合适的外植体，比如花药、幼胚、茎尖等，利用细胞的全能性，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株。组织培养仅仅是一个方法，其在育种上的应用关键是利用什么手段创造的变异外植体，不同方法创造的变异外植体，会有不同的预期目标和结果。植物嫁接能否用来创造遗传变异呢？大多的学术观点普遍认为植物嫁接的组织(砧木和接穗)保持各自的遗传完整性，其遗传物质不会混合；嫁接仅仅是一种无性繁殖，主要用来增强植物的抗逆性和适应性。通过嫁接可以产生变异也有一些报道，其中有关嫁接产生嵌合体以及嫁接诱导的遗传变异报道较多，但是否发生遗传物质的交换，学术上仍存在争论。但新近已有的对嫁接接合部组织的细胞学和分子生物学分析表明嫁接植物在砧木和接穗间可以交换各自的遗传信息(SandraStegemannandRalphBock，ExchangeofGeneticMaterialBetweenCellsinPlantTissueGrafts,Science,2009(324):649)。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种简便的通过嫁接创造变异的棉花育种方法，其育种效率高，其创造遗传变异的实质与有性杂交等不同，易于实现或达到所期望的育种目标。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是—种棉花育种方法，包括如下步骤，(1)培育嫁接苗选取待改良或具改良潜力的棉花品种/系作为接穗或砧木，播种于苗床或营养钵中，育成接穗株或砧木株；选取与前述接穗或砧木有优势互补性的棉花品种/系作为相对应的砧木或接穗，播种于苗床或营养钵中，育成砧木株或接穗株；当砧木株和接穗株具有12片真叶时，采用靠接法进行嫁接；将嫁接苗置于温度为2535°C、相对湿度为8595%、避免光照直射的环境中培养1015天；(2)选取外植体在嫁接1020天以后，选取上述通过靠接后成活的嫁接苗，沿其嫁接结合部两端剪开，保留嫁接结合部及其两端向外多余一点(35mm，为保留较多的嫁接结合部作出适当的预留，避免消毒时损伤到结合部的组织，在消毒处理后将该多余部分组织切除)的主茎组织(SandraStegemannandRalphBock的研究结果表明基因转移发生在嫁接部位，不会长距离发生)，将接口处的组织沿切口斜面一分为二，分为接穗外植体和砧木外植体；将接穗外植体和砧木外植体进行消毒；利用嫁接接口处的器官作为组织培养的外植体(explant)，进行植物组织培养，由于所选择的外植体不同，导致其灭菌方法、培养基的配制、配方、操作方法均不同，可根据实际情况进行选择、取舍。(3)愈伤组织的诱导培养切除接穗外植体和砧木外植体两端非嫁接结合部分，剩余部分切成约0.5cm长的切段，分别接入诱导培养基中进行诱导培养；(4)愈伤组织的增殖、继代培养将上述诱导的愈伤组织在培养3545天后，挑取淡黄色、疏松、有光泽的愈伤组织转移至继代培养基中进行继代培养；培养2535天后，将愈伤组织转入分化培养基；(5)胚状体萌发与植株再生经过分化，可以分化形成胚性愈伤组织，挑选心形或球形的胚状体，接入成苗培养基，待萌发形成再生植株后，转入大的三角瓶中培养，嫁接移栽或炼苗后直接移栽。所述步骤(1)中的嫁接方法为用锋利的刀片去除砧木株子叶上面的顶芽，保留其主茎上的一个子叶，沿砧木的主茎由上到下劈开11.5cm长的斜面；接着去除接穗株下部根及茎上的子叶，保留1个真叶的生长点及34cm长的主茎，将接穗下端削成一个斜面，刀口深度约11.5cm，然后将接穗和砧木切口的两个斜面靠在一起，至少保证砧木和接穗一侧的韧皮部密切结合，用嫁接夹或石蜡封口膜包裹固定嫁接结合部，1015天后去除嫁接夹或石蜡封口膜，嫁接棉花开始长出新叶，即表明嫁接成活。所述外植体消毒的方法是将外植体先用自来水冲洗后，滤纸吸干，放在70%酒精中浸泡12分钟，并轻轻摇动，取出后用蒸馏水冲洗35次，接着放在0.01%HgCl2中浸泡45分钟，并轻轻摇动，取出后用灭菌蒸馏水冲洗58次，使其不残留HgCl2。所述诱导愈伤、继代、分化、成苗培养条件为28士2t:，人工光照强度2000Lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时。所述愈伤组织诱导培养基为MS无机盐+B5维生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel(植物凝胶)2.5g/L，pH=5.8。所述继代培养基为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+蔗糖30g/L+2，4_Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。所述分化培养基为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L+蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。所述成苗培养基MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.Og/L+天门冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2)。所述砧木为中棉所24;所述接穗为转双价抗虫基因Bt+CpTI的中棉所41。所述棉花育种方法中还可包括外植体/再生植株变异的验证、筛选步骤分析在原砧木或接穗所存在的目标基因是否出现在相对应的接穗或砧木所形成的外植体/再生植株中，分析的方法可以为PCR扩增、分子标记、荧光原位杂交中的至少一种，若出现，则为可选的外植体/再生植株材料。所述棉花育种方法中还可以包括再生植株变异的验证、筛选步骤将再生植株与接穗或砧木相比，观察比较标记性状是否由砧木或接穗转移至对应的接穗或砧木所形成再生植株上，所述标记性状为花药的颜色、叶形、叶色、腺体的有无、花基斑的有无、棉籽短纤维的多少及有无中的至少一种；若标记性状不发生转移，可将再生苗移栽后收获的种子和砧木或接穗种子继续种植，对其后代进行多个性状的比较分析，来进一步筛选或确定所期望的或符合生产需要的品种/系。本发明具有积极有益的效果1.利用嫁接来创造遗传变异是比较简便的育种方法，不需要大量资金和昂贵精密仪器设备，可以在温室条件下周年开展。2.许多亲缘关系较远的属间植物，含有不同的染色体组，虽不能进行有性杂交，但它们可以相互嫁接在一起，因此，通过嫁接可以获得通常采用有性杂交无法获得的远缘变异；选取砧木与接穗远缘嫁接创造的变异体进行栽培，有可能改良植物的品质、产量、抗逆性等，比如棉属中的二倍体草棉和四倍体的陆地棉通过杂交是很难获得种子的，但通过嫁接就可能将草棉中的优良基因转移到陆地棉中。3.植物育种广泛存在有性杂交不亲和现象，往往还会遇到花期不遇、花粉败育等问题；而通过嫁接可以克服这些障碍，这是远缘杂交育种不可比拟的。通过嫁接，促使接合部愈伤组织产生兼具砧木、接穗双亲优良性状的变异类型，在植物育种生产实践中有更大的应用潜力。4.和有性杂交等的遗传变异不同，棉花嫁接创造的变异有自己的特点，首先砧木和接穗交换细胞核的遗传物质，主要是大的DNA片段，而非整个基因组信息，其次还可以发生细胞质中的遗传物质相互交换，这两点都与植物中常用的杂交育种不同，也与细胞育种不同；有性杂交是双亲各提供一半的染色体给子代，且子代的细胞质是母性遗传，这种变异叫基因的垂直转移；不通过有性杂交发生的基因转移称为水平基因转移，植物嫁接是水平基因转移的一种方式，这种变异应用到育种上，和有性杂交相比有几个优点(l)接穗和砧木的细胞核基因和细胞质基因均可能发生交换，导致变异的发生；(2)就细胞核基因来讲，只发生大的DNA片段转移，而不像有性杂交那样亲本将一半染色体均转移给子代，在目的片段转移的同时，也有许多累赘基因(不利性状的基因)也一起发生了转移；比如棉花的抗黄萎病育种，尽管一些海岛棉种质中含有抗黄萎病的DNA片段，但是有性杂交后，子代不仅发生极端的分离，且可能携带有晚熟、铃小、衣分低等不利性状的基因，而嫁接的遗传变异就可能解决这个问题，因为嫁接后有可能只发生抗黄萎病DNA片段的转移，这样就可能通过筛选获得只改良作物的某一劣势性状而保留其它优良性状的变异体，此外嫁接的遗传变异手段还可以克服植物远缘杂交引起的不育等问题。5.本发明提供一种新的棉花转基因手段，可以将目的基因(比如本发明实施例中所提到的抗虫基因)转移到所需改良的品种中；利用嫁接来创造遗传变异可作为常规育种和现代基因工程育种的一种辅助手段，是一条不容忽视的具有广阔前景的育种途径。具体实施例方式实施例1一种棉花育种方法，包括如下步骤(1)培育嫁接苗①育砧木株选取具有改良潜力的非转基因棉花中棉所24作为砧木，播种于苗床或营养钵中，育成砧木株；②育接穗株选取转双价抗虫基因Bt+CpTI的棉花品种中棉所41作为接穗，播种于苗床或营养钵中，育成接穗株；③嫁接当砧木株和接穗株具有12片真叶时，以靠接法嫁接用锋利的刀片去除砧木株子叶上面的顶芽，保留其主茎上的一个子叶，沿砧木的主茎由上到下劈开约1.5cm长的斜面；接着去除接穗株下部根及茎上的子叶，保留l个真叶的生长点及34cm长的主茎，将接穗下端削成一个斜面，刀口深度约11.5cm，然后将接穗和砧木切口的两个斜面靠在一起，至少保证砧木和接穗一侧的韧皮部密切结合，用嫁接夹或石蜡封口膜包裹固定嫁接结合部，将嫁接苗置于温度为3(TC、相对湿度为90%、避免光照直射的环境中培养，12天后去除嫁接夹或石蜡封口膜，嫁接棉花开始长出新叶，即表明嫁接成活。(2)选取外植体在嫁接15天后，选取上述通过靠接后成活的嫁接苗，将其剪断，保留接口处及接口两端向外多余一点的那段主茎组织(在消毒后以便将接口两端的非结合部组织切除，尽可能的保留较长的嫁接结合部组织)，将接口处的组织沿切口斜面一分为二，分为接穗外植体和砧木外植体；将接穗外植体和砧木外植体进行消毒先用自来水冲洗外植体，再以滤纸吸干，放在70%酒精中浸泡1.5分钟，并轻轻摇动，取出后用蒸馏水冲洗35次，接着放在0.01%HgCl2中浸泡45分钟，并轻轻摇动，取出后用灭菌蒸馏水冲洗58次，无HgCl2残留。(3)外植体愈伤组织的诱导培养切除接穗外植体和砧木外植体两端非嫁接接口部分，剩余部分切成约0.5cm长的切段，分别平接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养；将接穗外植体和砧木外植体接入不同的培养皿中，并置于28士2t:，人工光照强度2000Lx，每天光照培养14小时、黑暗培养10小时的条件下进行诱导培养；愈伤组织诱导培养基构成为:MS无机盐+B5维生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。(4)愈伤组织的增殖、继代、分化培养进行上述诱导培养40天后，挑取淡黄色、疏松、有光泽的愈伤组织转移至继代培养基中进行继代培养，培养条件为28士2t:，光照强度2000Lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养，继代培养基的配方为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+Bs维生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8)，培养2周后转入新鲜继代培养基中，如此继代培养23次后挑选长势良好的胚性愈伤组织转入分化培养基(MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8)中分化培养，每两周更换一次培养基。(5)胚状体萌发与植株再生从分化形成的胚性愈伤组织中挑选心形、球形等的胚状体，转入成苗培养基，待萌发形成再生植株后，转入大的三角瓶中培养，适时嫁接或待根长好后移栽。成苗培养基的配方MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.0g/L+天门冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2)。上述各种培养基所用到的母液成分构成及配制方法如下①MS大量元素母液(10X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>②MS微量元素母液(100X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>③MS铁盐母液(100X)称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升取培养基母液10ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注意配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶(烧杯)中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。④Bs维生素母液(100X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(6)遗传变异的验证及选择所选砧木中棉所24为非转基因棉花，接穗为转双价抗虫基因Bt+CpTI的棉花品种中棉所41，如果抗虫基因发生转移，则通过对砧木接口处的外植体进行组织培养而获得的再生苗中可检测到该抗虫基因。下面用PCR方法来检测用砧木接口处组织作外植体，获得的再生苗是否含有双价抗虫基因Bt+CpTI:①DNA的提取田间选取10克左右棉花植株的嫩叶(叶龄小于一周)混合，用液氮充分研磨至细粉状，装入50ml离心管中，加入100200illP-巯基乙醇，按5ml/g样的比例加入65。C左右的DNA裂解缓冲液(2%CTAB，2%PVP，O.1%DIECA，1.4MNaCl，O.02MNa2EDTA(pH8.0)，0.1MTris-HCl)，并迅速搅拌混匀，65。C水浴30min，间隔10min左右摇动一次，取出后加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，轻轻地混匀，3800r/min离心15min，取上清液至干净离心管，重新加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，混匀之后，3800r/min离心15min，将上清转到干净离心管中，加入2/3倍体积冰冻过的异丙醇，轻轻地上下颠倒直至絮状DNA沉淀产生，_201:冰箱内放置半个小时以上，然后挑出DNA至干净的离心管，用76%乙醇浸泡，特别是第一次换乙醇应在半小时以内，中间注意换乙醇23次，然后倒去乙醇风干，最后加一定体积的TE溶解。用DNA紫外分光光度计测浓度，并将其稀释到10ng/ii1的浓度。②双价抗虫基因Bt+CpTI的特异引物序列为5'-AGATGTCCATCAAGTGTGG—3'5'-TACAATAACAATGGACTGC-3'PCR的反应体系为20iil的PCR反应体系含2XPCR缓冲液，15mmol/LMgCl2，200iimol/L的dNTPs，每个引物浓度为0.5iimol/L，0.5U的Taq酶和100ngDNA模板，不足部分由H^补足并上覆25iU左右的矿物油。PCR反应程序如下95。C变性3min，1个循环；94。C变性lmin，58。C退火lmin，72°C延伸1.5min，35个循环；72°C5min;4。C保存。扩增产物由1%的琼脂糖水平电泳系统检测。以砧木的接口组织作为外植体，通过组织培养的方法共获得36株再生苗，通过PCR检测，发现有3株棉花含有接穗的双价抗虫基因Bt+CpTI，说明该基因发生了转移。对于所获得的36株再生苗，仅以棉花的双价抗虫基因为目的基因，来验证是否发生了转移来证明通过嫁接发生的水平基因转移能否应用到植物育种上，但是，对于其它再生苗，是否也发生了其它基因的水平转移，可通过分子标记、荧光原位杂交等技术来进行相应验证筛选工作。而对于育种工作者来讲，只要将其收获的种子和砧木或接穗种子继续种植，后代进行多个性状的比较分析，就可确定哪些性状的基因发生了转移。此外，利用本发明方法的思路，也可以应用到其它植物的遗传育种研究当中，还可以创造一些新的遗传材料，比如棉花染色体片段置换系、异染色体片段系等的构建，用来进行基因定位、分子设计育种等的研究。9权利要求一种棉花育种方法，包括如下步骤(1)培育嫁接苗选取待改良或具改良潜力的棉花品种/系作为接穗或砧木，播种于苗床或营养钵中，育成接穗株或砧木株；选取与前述接穗或砧木有互补性状的棉花品种/系作为相对应的砧木或接穗，播种于苗床或营养钵中，育成砧木株或接穗株；当砧木株和接穗株具有1～2片真叶时，采用靠接法进行嫁接；将嫁接苗置于温度为25～35℃、相对湿度为85～95％、避免光照直射的环境中培养10～15天；(2)外植体的选取在嫁接10～20天以后，选取上述通过靠接成活的嫁接苗，沿其嫁接结合部两端剪断，保留嫁接结合部及其两端向外多余一点的主茎组织，将接口处的组织沿切口斜面一分为二，分为接穗外植体和砧木外植体；将接穗外植体和砧木外植体进行消毒；(3)外植体愈伤组织的诱导培养切除接穗外植体和砧木外植体两端非嫁接接口部分，剩余部分切成约0.5cm长的横切段，分别接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养；(4)愈伤组织的增殖、继代培养上述诱导培养35～45天后，挑取淡黄色、疏松、有光泽的愈伤组织转移至继代培养基中进行继代培养；培养25～35天后，将愈伤组织转入分化培养基；(5)胚状体萌发与植株再生经过继代培养基的分化，可以分化形成胚性愈伤组织，挑选心形或球形的胚状体，接入成苗培养基，获得再生植株后，转入大的三角瓶中，进行炼苗后的嫁接移栽或直接移栽。2.根据权利要求1所述的棉花育种方法，其特征在于，所述步骤(1)中的嫁接方法为用锋利的刀片去除砧木株子叶上面的顶芽，保留其主茎上的一个子叶，沿砧木的主茎由上到下劈开11.5cm长的斜面；接着去除接穗株下部根及茎上的子叶，保留1个真叶的生长点及34cm长的主茎，将接穗下端削成一个斜面，刀口深度约11.5cm，然后将接穗和砧木切口的两个斜面靠在一起，至少保证砧木和接穗一侧的韧皮部密切结合，用嫁接夹或石蜡封口膜包裹固定嫁接结合部，1015天后去除嫁接夹或石蜡封口膜，嫁接棉花开始长出新叶，即表明嫁接成活。3.根据权利要求1或2所述的棉花育种方法，其特征在于，所述外植体消毒的方法是将外植体先用自来水冲洗后，滤纸吸干，放在70%酒精中浸泡12分钟，并轻轻摇动，取出后用蒸馏水冲洗35次，接着放在0.01%HgCl2中浸泡45分钟，并轻轻摇动，取出后用灭菌蒸馏水冲洗58次，使其不残留HgCl2。4.根据权利要求3所述的棉花育种方法，其特征在于，所述诱导愈伤、继代、分化、成苗培养条件均为28士2t:，人工光照强度2000Lx，每天光照培养14小时、黑暗培养10小时。5.根据权利要求4所述的棉花育种方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为MS无机盐+B5维生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。6.根据权利要求5所述的棉花育种方法，其特征在于，所述继代培养基为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+Bs维生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。7.根据权利要求6所述的棉花育种方法，其特征在于，所述分化培养基为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L+蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8;所述成苗培养基为MS无机盐-NH4N03+2XKN03+B5维生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.0g/L+天门冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2。8.根据权利要求7所述的棉花育种方法，其特征在于，所述砧木为中棉所24;所述接穗为转双价抗虫基因Bt+CpTI的中棉所41。9.根据权利要求8所述的棉花育种方法，其特征在于，还包括外植体/再生植株变异的验证、筛选步骤分析在原砧木或接穗所存在的目标基因是否出现在相对应的接穗或砧木所形成的外植体/再生植株中，分析的方法可以为PCR扩增、分子标记、荧光原位杂交中的至少一种，若出现，则为可选的外植体/再生植株材料。10.根据权利要求1所述的棉花育种方法，其特征在于，还包括再生植株变异的验证、筛选步骤将再生植株与接穗和砧木相比，观察比较标记性状是否由砧木或接穗转移至对应的接穗或砧木所形成再生植株上，所述标记性状为花药的颜色、叶形、叶色、腺体的有无、花基斑的有无、棉籽短纤维的多少及有无中的至少一种；若标记性状不发生转移，可将再生苗移栽后收获的种子和砧木或接穗种子继续种植，对其后代进行多个性状的比较分析，进一步筛选、确定所期望的或符合生产需要的品种/系。全文摘要本发明涉及一种棉花育种方法。该方法是利用棉花嫁接产生的遗传变异结合部为外植体，诱导培养出愈伤组织，经愈伤组织的增殖、继代培养，进而分化培养成棉苗，再进行炼苗后的嫁接移栽或直接移栽的育种方法。本发明利用嫁接创造遗传变异，既有可能改良植物的品质、产量、抗逆性等，还可以获得通常采用有性杂交无法获得的远缘变异，操作简便、选育效率高且成本低；本发明提供一种新的棉花转基因手段，可以将目的基因转移到所需改良的品种中产生兼具砧木、接穗双亲优良性状的变异类型；利用嫁接来创造遗传变异可作为常规育种和现代基因工程育种的一种辅助手段，是一条不容忽视的具有广阔前景的育种途径。文档编号A01G1/00GK101707963SQ20091022771公开日2010年5月19日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者郝俊杰申请人:河南省农业科学院