专利名称：百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养，具体地说，涉及百合(Liliumlongiflorum)的组织培 养和无菌苗叶片器官直接发生的方法。
背景技术：
近年来，百合以其花朵大型、色彩丰富、气味芳香而被世界各国人民所喜爱，迅速 占据世界切花市场。其中，亚洲百合杂种系、东方百合杂种系、麝香百合杂种系为主要的切 花种类。切花生产所用种球依赖进口这是一个不争的事实。并且进口百合鳞茎在第二年往 往会退化，所以每年均需要进口。虽然百合的鳞片扦插和组织快繁的研究有很多报道，但是鳞片扦插容易引起种性 退化的问题，而组织快繁再生产中应用较少，因为试管苗移栽时容易大量死亡。由于这些方 法还不能够满足百合种球生产需求，因此，需要探索新的百合鳞茎快繁方法，并且形成相关 的种球生产技术体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法及其应用。百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法，包括将无菌苗的叶盘接种至小鳞茎 诱导培养基，再将诱导的小鳞茎接种至小鳞茎膨大培养基，其中所述的小鳞茎诱导培养基 为MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L，所述的小鳞茎膨 大培养基为=MS+活性炭(AC) 2. O 2. 5g/L+蔗糖90g/L+琼脂6. 25g/L。其中，所述百合叶盘接种后进行暗培养，所述小鳞茎接种至小鳞茎膨大培养基 后进行光照培养，所述的光照条件为自然散射光2500 3000LUX加人工辅助光1500 2000Lux，光照时间为12h/d。本发明提供的百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法，还包括制备百合无 菌苗，具体为将百合鳞片表面灭菌后接种至丛生芽诱导培养基，诱导产生丛生芽，将诱 导的丛生芽的单芽接种至丛生芽增殖培养基，获得大量无菌苗。其中所述的丛生芽诱 导培养基为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L，或 MS+6-BA2. 0mg/L+2，4-D 0. 1 0. 5mg/L+蔗糖 25 35g/L+琼脂 6. 25g/L，或MS+6-BA2. Omg/ L+IAA 0. lmg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L,优选为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂6. 25g/L，其中所述的丛生芽增殖培养基为MS+6-BAl. 0 2. 5mg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L,优选为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L。本发明提供的百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法可应用与百合鳞茎的 快速繁殖。与传统的百合鳞茎发生途径相比较，叶片直接诱导产生小鳞茎的方法有以下优
点
(1)在丛生芽诱导的基础上，再次扩大了诱导率，(一个单芽可以产生3 8个叶 片，每个叶片又可以产生ι 3个小鳞茎，)。因此，比传统的丛生芽诱导小鳞茎诱导率提高 了 3 24倍。(2)缩短了鳞茎膨大的培养时间，传统的单芽培养成小鳞茎需要较长的时间，而叶 片直接产生的小鳞茎，大小均勻、整齐一致，在膨大培养基上生长一个月后，即产生鳞片叶。(3)叶片直接产生的小鳞茎带有较长的根，不需要专门的诱导生根阶段。
图1是鳞片接种45天后的诱导情况。图2是鳞片诱导的不定芽继代45天之后的生长情况。图3是单芽诱导90天之后的生长情况。图4 是叶盘在 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L 的诱导 情况。图5是诱导出的小鳞茎在MS+AC2. Og/L+蔗糖90g/L+琼脂6. 25g/L接种一个月的 生长情况。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1百合鳞片诱导选取无病虫害的购买自北京绿尔有限公司的‘西伯利亚’百合鳞 片，用洗洁精清洗后，在自来水下冲洗30min，用75 %酒精浸泡35s，无菌水冲洗两次，再 用0. 升汞灭菌不同时间，即外层鳞片灭菌15min，中层鳞片灭菌12min，内层鳞片灭菌 lOmin，无菌水冲洗4 5次，然后在无菌滤纸的培养皿中切块备用。将上述表面灭菌的百合鳞片接种至MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L ；MS+6-BA2. Omg/ L+NAA 0. lmg/L ；MS+6-BA2. 0mg/L+2，4_D 0. 5mg/L ；MS+6-BA2.0mg/L+2，4_D 0. lmg/L ； MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. lmg/L。其中，上述培养基中，蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为6. 25g/ L0结果表明，‘西伯利亚’外层鳞片采用升汞灭菌15min后，不定芽诱导率最高为 48. 56%，高于中层鳞片的39. 26%和内层鳞片的28. 18%的不定芽诱导率。鳞片不同层数分化系数的比较在MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼 脂6.25g/L的诱导培养基上，‘西伯利亚’的中层鳞片的平均分化系数为5. 2，外层鳞片为 3. 0，内层鳞片为2. 73。其中，平均分化系数是指每个已分化的鳞片所分化的不定芽的平均 数。将‘西伯利亚，鳞片接种至上述5种诱导培养基中，其中MS+6-BA2. 0mg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂6. 25g/L的培养基的诱导分化率最高(图1)，为42. 87%。将诱 导出的不定芽在上述培养基中进行继代，不定芽继续增殖(图2)。实施例2将鳞片上分化出的丛生芽切割成单芽接种至下述八种培养基中A:MS+6-BAl. 0mg/L+NAA0. lmg/L ；
B:MS+6--BAl.0mg/L+NAA0.5mg/L
C:MS+6--BAl.5mg/L+NAA0.lmg/L
D:MS+6--BAl.5mg/L+NAA0.5mg/L
E:MS+6--BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L
F:MS+6--BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L
G:MS+6--BA2.5mg/L+NAA0.lmg/L
H:MS+6--BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L。其中，上述培养基中，蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为6. 25g/L。在A培养基上丛生芽增长系数为2. 76，小苗长势良好；在B培养基上丛生芽增长 系数为3. 17，小苗长势较好；在C培养基上丛生芽增长系数为2. 97，小苗长势差；在D培养 基上丛生芽增长系数为3. 96，小苗长势良好；在E培养基上丛生芽增长系数为3. 20，小苗长 势较好；在F培养基上丛生芽增长系数为4. 23，小苗长势良好；在G培养基上丛生芽增长系 数为4. 13，小苗玻璃化；在H培养基上丛生芽增长系数为3. 12，小苗玻璃化。因此，从单芽分化系数和丛生芽的质量来看，‘西伯利亚’在培养基MS+6-BA2. Omg/ L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6. 25g/L上分化系数达到4. 23，小苗长势良好(图3)。实施例3无菌苗叶片直接诱导小鳞茎培养基的筛选选取生长健壮的‘西伯利亚’无菌苗， 将叶片剪成3cm左右的叶盘，接种至以下4种培养基中，其中培养容器为培养皿MS+Pic (毒锈定)2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L ； MS+Pic (毒锈定)2. Omg/L+KTO. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L ；MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L ；MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L。将接种过叶盘的培养皿置于纸盒子内，再将纸盒子放置在完全黑暗的人工气候箱 内。整个过程中组培苗的培养温度为20 23°C。其中，在培养基MS+Pic (毒锈定)2. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂6. 25g/L上，单芽的诱 导率为 2. 77%,而培养基 MS+Pic (毒锈定)2. Omg/L+KTO. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/ L上，单芽诱导率为16. 16%。在培养基MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂 6. 25g/L上，可以直接诱导出小鳞茎，但诱导率为14. 32%，在培养基MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6. 25g/L上小鳞茎诱导率达到29. 58 %，小鳞茎的诱导系数为 1 3个，并且在小鳞茎上直接生长出细弱而长的根(图4)。实施例5将实施例4诱导获得的小鳞茎切割下来，接种至膨大培养基MS+AC (活性炭)2. Og/ L+蔗糖90g/L+琼脂6. 25g/L中，一个月后，鳞茎膨大速度较快，并且迅速分化出鳞片叶(图 5)。若无特殊说明，上述培养过程中光照条件为自然散射光2500 3000LUX加人工辅 助光1500 2000Lux，光照时间为12h/d，培养温度为20 23°C。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法，包括将百合无菌苗的叶盘接种至小鳞茎诱导培养基，再将诱导的小鳞茎接种至小鳞茎膨大培养基，其中所述的小鳞茎诱导培养基为MS+6 BA2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6.25g/L，所述的小鳞茎膨大培养基为MS+活性炭2.0～2.5g/L+蔗糖85～95g/L+琼脂6.25g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小鳞茎诱导培养基为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小鳞茎膨大培养基为MS+活性炭 2. Og/L+ 蔗糖 90g/L+ 琼脂 6. 25g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的叶盘接种至小鳞茎诱导培养基后 进行暗培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括制备所述的百合无菌苗，其步骤包括将百合鳞片表面灭菌后接种至丛生芽诱导培养基，诱导产生丛生芽，将诱导的丛 生芽的单芽接种至丛生芽增殖培养基，获得无菌苗，其中所述的丛生芽诱导培养基为 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L,或 MS+6-BA2. Omg/ L+2，4-D 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L,或 MS+6-BA2. 0mg/L+IAA 0. Img/ L+蔗糖25 35g/L+琼脂6. 25g/L，其中所述的丛生芽增殖培养基为MS+6_BA1. 0 2. 5mg/ L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 6. 25g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的丛生芽诱导培养基为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的丛生芽增殖培养基为 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6. 25g/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的鳞片为外层鳞片。
9.权利要求1 8任一项所述的方法在百合鳞茎快速繁殖中的应用。
全文摘要
本发明提供了百合(Lilium longiflorum)组培苗叶片直接诱导小鳞茎的快速繁殖方法，步骤为将百合无菌苗的叶盘接种至小鳞茎诱导培养基，再将诱导的小鳞茎接种至小鳞茎膨大培养基，其中所述的小鳞茎诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，所述的小鳞茎膨大培养基为MS+活性炭2.0～2.5g/L+蔗糖90g/L+琼脂6.25g/L。本发明的百合无菌苗叶片直接诱导小鳞茎的繁殖方法，一个叶盘能够产生1～3个小鳞茎。鳞茎直接产生根的诱导率达到100％，与鳞片直接诱导丛生芽，再产生小鳞茎的过程相比，缩短了时间，简化了步骤，为新发现的一条器官直接发生途径。
文档编号A01H4/00GK101971775SQ201010511389
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者孔滢, 孙明, 张启翔, 杨炜茹, 石晋芳, 程堂仁 申请人:北京林业大学