专利名称：悬浮共培养将人参总dna导入马铃薯单细胞的方法
技术领域：
本发明涉及作物分子育种领域，特别是涉及马铃薯的分子育种方法，具体涉及一 种采用悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞获得马铃薯转基因植株的方法。
背景技术：
植物分子育种是不经过有性过程，将外源DNA导入受体植物，产生可遗传的变异， 以选育带有目的性状的优良品种的育种技术(周光宇等，中国农业科技出版社，1993)。它 克服了常规育种方法周期长、预见性差、选择效率低的局限性，可以打破物种界限，实现优 良基因重组和聚合，能够对农作物新品种定向选育，使得分子育种成为育种研究的热点。人参作为贵重药材之一，应用于中医临床已有两千多年的历史，具有广泛的药理 作用和医疗用途。研究表明，从人参中分离出的人参皂苷被认为是人参主要的有效成分之 一，其中人参皂苷RBl在抗氧化、清除氧自由基、心血管系统以及逆转肿瘤细胞耐药等方面 有较强活性。马铃薯是全世界主要粮食作物之一，具有生育期短、产量高、适应性强等特点， 越来越受到全世界的广泛重视。但由于马铃薯普通栽培品种是同源四倍体，遗传组成的复 杂性和遗传背景的狭窄制约马铃薯育种发展的主要因素，常规育种进展缓慢。1974年，周光宇提出“DNA片段杂交”假设，并模拟远缘杂交外源DNA通过花粉管 路线，培育成棉花和水稻新品种。应用“花粉管通道法”、“浸苗法”等方法将外源DNA导入 植物已成为一种新的有效的遗传转化方法。总DNA直接导入法逾越了常规育种中的生殖障 碍，弥补了细胞工程技术繁琐、植株再生频率低、后代群体小，难以筛选的缺陷，被公认是实 现远缘杂交的有效途径，并在多种作物中得到了能稳定遗传的优良品系。朱生伟等应用“浸 苗法”成功地将外源DNA导入烟草，导入后代在形态、品质和成分等方面已产生广泛的变异。随着基因工程技术的发展，植物功能基因分离技术也不断完善。Witty等用发根农 杆菌介导的转化方法获得了转甜蛋白基因(thaumatin)的马铃薯，并检测到了活性甜蛋白 的表达。盛万民等把类型I和类型II的240ku蛋白基因的5’端启动子序列(2. 5ku)连接 到T质粒双元载体PBl 101. 1的β-葡糖苷酸酶(⑶S)基因上，转入农杆菌株LBA4404，对马 铃薯进行转化，获得了蛋白质高水平表达的转基因植株。从这些报道显示，虽然采用1-2个 已知功能的基因导入马铃薯的确能够提高块茎的蛋白质含量和质量，但步骤繁琐、转化效 率低、提高的幅度最高也仅为20%，且抗生素等抗性选择标记还可能存留。洪亚辉等以马铃薯愈伤组织的小细胞团作为受体，利用静止的浸泡共培法导入人 参总DNA，虽然得到转化体植株，但转化效率极低，仅为2-3%，且转化后代的蛋白质含量并 没有提高。而采用悬浮共培养将外源DNA导入单细胞的方法来改良作物品质的操作在马铃 薯方面从未有人尝试过。因此，本领域中仍然需要一种新的大幅度提高马铃薯蛋白质含量 的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种快速且操作简便的悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，可改良马铃薯的营养品质。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种悬浮共培养将人参总 DNA导入马铃薯单细胞的方法，该方法包括如下步骤(1)、马铃薯细胞悬浮培养物的培养将长为0. 8-1. 2cm的马铃薯茎段灭菌后接种 到置放有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种6-7块，该诱导培养基是MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，培养条件为温度25_28°C，光照3000Lux，光照时间12_14h/ d，培养10天；再继代培养5天，继代次数为1次，选取茎段两侧膨大显著、茎段中部增粗、外 观疏松、颜色呈亮黄色的愈伤组织作为悬浮细胞，转移到液体悬浮培养基MS+NAA 0. 4mg/ L+6-BA2mg/L+蔗糖30g/L中，在摇床100-120转/min，25-28 °C，黑暗条件下，培养3_5天 后，将三角瓶壁上的细胞全部刮取下来，移入到体积比为2 1的新旧混合的液体悬浮培养 基MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，悬浮培养2_4天，继代1次(通过刮取瓶 壁上的细胞获得马铃薯细胞悬浮培养的继代材料，并通过镜检观察，筛选分散性好的细胞 作为继代培养)；O)、分离悬浮细胞中的单细胞先选用孔径为30目细胞筛过滤除去细胞悬浮培 养物中的大愈伤组织，再根据镜检观测的细胞大小选用孔径为60-120目的第二层细胞筛 滤去小细胞团，然后选用孔径为300目的第三层细胞筛得到分散的单细胞悬浮液，最后选 用孔径为400目细胞筛过滤除去悬浮液中的杂质，得到马铃薯单细胞；(3)、人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养获得人参总DNA，人参总DNA的浓度 为350-400ug/ml ；将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养，培养条件为摇床120-150转/ min，温度 2548°C，培养液为 MS+NAA 0. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗糖 40g/L，黑暗培养 6-8 天；0)、获得试管苗，经培养获得种薯将共培养后的马铃薯单细胞转到 MS+NAAO. 05mg/L+6BA 2. 0mg/L+GA3 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 8g/L 的分化培养基上诱导 单细胞不定芽分化，培养条件是温度25-28 °C，光照3000LUX，光照时间14-Wh/d，将分化 出的不定芽转到1/2MS+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的生根培养基上诱导生根培 养，培养条件是温度25-28°C，光照3000LUX，光照时间14_16h/d，获得试管苗，进行RAPD 分子检测，筛选出含有马铃薯对照体和人参供体相同条带的试管苗作外植体再诱导愈伤组 织并分化、生根培养成苗，经培养获得种薯。上述将马铃薯茎段灭菌是指将冲洗干净的马铃薯茎段用体积浓度75%的乙醇消 毒30s，用0. 升汞溶液消毒7-8min，最后用无菌水漂洗3次。上述人参总DNA可以从人参组织如根、茎、叶、中获得。从人参组织中获得人 参总DNA的方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如可采用(Bendich A. J，Plant Physiology, 1967,42 (7) :959-967)报道的快速提取植物组织DNA的方法来制备获得人参 总DNA，只需获得的人参总DNA的浓度为350-400ug/ml即可。在本发明方法中，RAPD分子检测可采用本领域常规技术(王秀玲等，南开大学学 2003, 36 (2) 37-40)进行。在本发明方法中，马铃薯愈伤组织诱导培养、继代培养、分化培养和生根培养方法 是本领域技术人员所熟知的，例如可参见(Lan S. L, Am Potato J，1977，54 :575-580)的 方法。在本发明方法中，获得马铃薯种薯后，可采用常规方法(孙慧生，中国农业出版社， 2003,283-340)使马铃薯种薯生长并栽培获得后代块茎，然后选出蛋白质有所提高的单株进行播种，连续数代后得到遗传性稳定的块茎。马铃薯块茎的蛋白质含量、氨基酸含量和 人参RBl的测定可用本领域常规技术进行(Samakana KI, Chem Pharm Bull, 1995,43(1) 137-141)。本发明方法中所用的人参和马铃薯并不局限于任何特定的品种(系)，但是为了 使马铃薯蛋白质含量有较大的提高，宜选用蛋白质含量较高的品系。另外，在选择马铃薯品 系，应根据马铃薯抗病性、产量等性状来选择较好的马铃薯品种(系)作为受体。本发明建立了一种快速且操作简便的改良马铃薯营养品质的方法，利用该方 法获得的马铃薯第一代块茎在蛋白质、总氨基酸、赖氨酸含量上最高可分别比对照提高 47. 96%,46. 13%、86.M%。而且，经过对其后代的表型分析，没有发现其它明显的表型变 异现象，其高产、抗病性等性状并没有因为块茎蛋白质含量和质量的提高而发生变化，在后 代可获得能够稳定遗传的高蛋白品系。
图1是本发明的人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养的后代中人参皂苷RBl的 色谱图。图2是本发明的人参样品中皂苷RBl的色谱图。
具体实施例方式下面将以具体实例对本发明作进一步地说明实施例1在本实施例中，外源人参总DNA供体为新鲜人参，受体马铃薯由湖南省马铃薯工 程技术研究中心提供的高产、抗病性好的大西洋。1、将冲洗干净的马铃薯茎段用体积浓度75%的乙醇消毒30s，用0. 升汞溶液 消毒7-8min，最后用无菌水漂洗3次，接种到诱导培养基中，每瓶接种6_7块外植体，该 诱导培养基是MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA ang/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，，培养条件是温度 25-28°C，光照3000LUX，光照时间12_14h/d，培养10天，再继代培养5天(继代1次)，选 取茎段两侧膨大显著、茎段中部增粗、外观疏松、颜色呈亮黄色的愈伤组织作为悬浮细胞培 养。2、马铃薯细胞悬浮培养的条件为摇床100-120转/min，25-28 °C，黑暗培养 3-5天后将三角瓶壁上的细胞全部刮取下来，移入新旧混合的液体悬浮培养基(MS+NAA 0. 4mg+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L)，其体积比为2 1，悬浮培养2_4天，继代1次(通过镜检 观察，筛选分散性好的细胞作为继代培养)。3、采用四层细胞筛过滤得到单细胞，首先选用孔径为30目细胞筛过滤除去细胞 悬浮培养物中的大愈伤组织，再根据镜检观测的细胞大小选用孔径为120目的第二层细胞 筛滤去小细胞团，然后选用孔径为300目的第三层细胞筛得到分散的单细胞悬浮液，最后 选用孔径为400目细胞筛过滤除去悬浮液中的杂质，经镜检观察得到马铃薯单细胞。4、将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养，共培养条件为摇床120-150转/min， 25-28"C，人参总 DNA 的浓度为 350_400ug/ml，培养基为 MS+NAAO. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗 糖 40g/L，黑暗培养 6-8 天后，转到 MS+NAA 0. 05mg/L+6BA2. 0mg/L+GA3 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+琼脂8g/L的分化培养基上诱导单细胞不定芽分化，培养条件为温度2548°C，光照 3000LUX，光照时间14-lMi/d，将分化出的不定芽转到1/2MS+NAA 0. ang/L+蔗糖30g/L+琼 脂8g/L的生根培养基上诱导生根培养，培养条件为温度2548°C，光照3000LUX，光照时 间14-16h/d，获得试管苗，进行RAPD分子检测，筛选出含有马铃薯对照体和人参供体相同 条带的试管苗作外植体再诱导愈伤组织并分化、生根培养成苗，经培养获得种薯。其中，试 管苗可培养成215株完整植株，经检测，转基因植株为26株，转化率是12. 1 %。5、从第一代材料中，筛选出蛋白质含量较高的单株分别进行播种，获得第二代马 铃薯块茎。再筛选出蛋白质含量较高的单株分别继续种植获得第三代马铃薯块茎，同样操 作收获第四代块茎。6、如表1所示，对转化成功的第一代马铃薯后代块茎中任意抽取5个单株块茎，其 蛋白质含量比对照有明显提高，方差分析显示，与对照组都有极显著的差异(P < 0.01)，第 一代块茎蛋白质含量最高可比对照提高47. 96%。再分别对转化和未转化的马铃薯、人参样 品进行人参皂苷RBl的测定中，检测出转化马铃薯和人参样品中有相同的人参皂苷RBl峰 波，而在未转化马铃薯中没有检测到此峰波(见图1和图2)。在检测第一代马铃薯块茎蛋白质含量的基础上，对高蛋白单株的块茎进行氨基酸 含量分析(结果见表1)。测定结果显示，高蛋白变异后代随着块茎蛋白质含量增加的同时， 块茎总氨基酸和各种氨基酸含量也有明显提高。经直线相关分析显示，马铃薯后代块茎总 氨基酸含量也都呈正相关关系。对照块茎赖氨酸含量为0. 52%，经人参总DNA与马铃薯单 细胞悬浮共培养后获得的高蛋白马铃薯块茎赖氨酸含量最高值达到0. 97%，比对照提高了 86. M%。第一代高蛋白材料又经过三代继续种植筛选，在第四代获得了蛋白质含量能够稳 定遗传的高蛋白株系。综合四代的分析结果可以得知，采用悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞 的方法能够提高块茎的蛋白质含量和质量，而且效果很好。虽然导入人参的总DNA不是一个目的性非常明确的高蛋白基因，而且由于没有抗 性标记基因协助筛选，从而增加了后期筛选的工作量。但从食品的安全性角度考虑，目前许 多可能存留抗生素等抗性选择标记基因的转基因作物的推广已受到限制，而本发明中采用 悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法培育的高蛋白马铃薯中不存在任何可 能影响动物或人类的不利基因，因此其推广不会受到限制。在本发明实施过程中，对经过人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养的后代进行 表型分析，没有发现其它明显的表型变异现象，其高产、抗病性等性状并没有因为块茎蛋白 质含量和质量的提高而发生变化，所以在后代可获得能够稳定遗传的高蛋白品系。在本发 明中成功培育高蛋白马铃薯品系表明，将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养的方法不 仅可以快速有效地提高马铃薯块茎的蛋白质含量和质量，而且还能克服马铃薯高产与高蛋 白之间的负相关性。最后应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照 上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发 明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应 涵盖在本发明的权利要求范围当中。表1人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养的第一代马铃薯后代块茎各氨基酸权利要求
1.一种悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，其特征在于该方法包括 如下步骤(1)、马铃薯细胞悬浮培养物的培养将长为0. 8-1. 2cm的马铃薯茎段灭菌后接种到置 放有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种6-7块，该诱导培养基是MS+NAAO. 4mg/L+6-BA 2mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，培养条件是温度25-28°C，光照3000Lux，光照时间12_14h/d， 培养10天；再继代培养5天，继代次数为1次，选取茎段两侧膨大显著、茎段中部增粗、外 观疏松、颜色呈亮黄色的愈伤组织作为悬浮细胞，转移到液体悬浮培养基MS+NAA 0. 4mg/ L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，在摇床100-120转/min，2548°C，黑暗条件下，培养3_5天 后，将三角瓶壁上的细胞全部刮取下来，移入到体积比为2 1的新旧混合的液体悬浮培养 基MS+NAA 0. 4mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖30g/L中，继代悬浮培养2_4天，继代次数为1次； O)、分离悬浮细胞中的单细胞先选用孔径为30目细胞筛过滤除去细胞悬浮培养物 中的大愈伤组织，再根据镜检观测的细胞大小选用孔径为60-120目的第二层细胞筛滤去 小细胞团，然后选用孔径为300目的第三层细胞筛得到分散的单细胞悬浮液，最后选用孔 径为400目细胞筛过滤除去悬浮液中的杂质，得到马铃薯单细胞；(3)、人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养获得人参总DNA，人参总DNA的浓度为 350-400ug/ml ；将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养，培养条件为摇床120-150转/ min，温度 2548°C，培养液为 MS+NAA 0. 5mg/L+6-BA 2mg/L+ 蔗糖 40g/L，黑暗培养 6-8 天； 、获得试管苗，经培养获得种薯将共培养后的马铃薯单细胞转到MS+NAAO. 05mg/ L+6BA 2. 0mg/L+GA35. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基上诱导单细胞不定芽分化， 培养条件为温度2548°C，光照3000LUX，光照时间14_16h/d，将分化出的不定芽转到 1/2MS+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基上诱导生根培养，培养条件为温度 2548°C，光照3000LUX，光照时间14_16h/d，获得试管苗，进行RAPD分子检测，筛选出含有 马铃薯对照体和人参供体相同条带的试管苗作外植体再诱导愈伤组织并分化、生根培养成 苗，经培养获得种薯。
2.如权利要求1所述的悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，其特征在 于所述步骤(1)中将马铃薯茎段灭菌是指将冲洗干净的马铃薯茎段用体积浓度75%的乙 醇消毒30s，用0. 升汞溶液消毒7-8min，最后用无菌水漂洗3次。
全文摘要
一种悬浮共培养将人参总DNA导入马铃薯单细胞的方法，该方法包括如下步骤马铃薯细胞悬浮培养物的培养；分离悬浮细胞中的单细胞；将人参总DNA与马铃薯单细胞悬浮共培养；获得试管苗，经培养获得种薯。本发明方法获得的马铃薯后代块茎中含有人参皂苷RB1，且氨基酸、蛋白质含量大幅度提高，而其他性状并没有因为块茎蛋白质含量和质量的提高而变化。
文档编号A01H4/00GK102124949SQ20101059571
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者洪亚辉, 熊兴耀, 程鹏 申请人:湖南农业大学