专利名称：滋养节杆菌Ar13及其作为植物根际促生菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及滋养节杆属菌株及其应用，具体地,涉及滋养节杆菌(Arthrobacterpascens) Ar 13及其作为植物根际促生菌的应用。
背景技术：
农业生产中，农药和化肥的大量使用在提高作物产量的同时也产生了极大的环境问题，使用植物根际促生菌作为生物肥料，被视为ー种可减少农业化肥的替代品。随着现代生物科学技术的进歩，人们对微生物-植物共生系统给予了高度重视，并在多个方面有广泛的研究与应用植物根际环境中的微生物与植物存在共生关系，表现在植物的生长发育、营养物质的吸收利用、病害控制等方面，通过调整根际环境中的有益微生物菌株数量与质量，即可实现农作物高产、稳产。植物根际促生菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria,简称 PGPR),是寄居于植物根际、根表的微生物，能够直接或间接的促进植物的生长和发育。PGPR以其特有的病害生防潜力和对生态环境的维护作用，近年来已受到国内外越来越多的青睐。传统的研究主要研究有益菌株的活体应用能力，现代研究则趋向于利用生物技术研究促生和生防机制，了解其促生功能的本质，从而为更加合理有效地应用PGPR开辟了更加广阔的空间。目前，已从土壌中分离的根际细菌中获得了大量的植物根际促生菌，尤以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)在很多植物的根际都占有绝对优势,可达60% -93%的比例。澳大利亚、美国、欧盟合作组织、日本等多个国家都开展了 PGPR的专项研究，也在促进植物生长、増加作物产量，有效地用于植物病害的生物防治方面积累了大量的事实。有关植物根际促生菌制剂的研究与应用尤为活跃，主要涉及促进植物生长和防治作物病虫害这两个方面。促生作用指PGPR合成的次生代谢产物等增强植物对营养元素、水分的吸收。同吋，PGPR可通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害根际微生物间接促进植物生长。PGPR对病原菌的作用机制则主要有竞争和定殖、产嗜铁素、抗生作用、系统诱导抗性等。目前，国内外PGPR制剂应用广泛，最早成功地应用和商业化生产的PGPR是枯草芽饱杆菌A13，A13能抑制植物病原菌，促进多种植物生长，用A13处理种子，可以提高胡萝卜产量48%，燕麦产量33%和花生产量37%。商业化最成功的产品是Agrobacteriumradiobacter K84,目前美国上市的突光假单孢菌类PGPR生物制剂就有8种以上。节杆菌(Arthrobacter sp.)为革兰氏阳性菌,在自然界中广泛存在,模式种为球形节杆菌(Artrobacter globiformis)。节杆菌在生活史中细胞形态有显著变化,幼龄菌体完全或大部分是杆状或不规则杆状，老细胞则缩短为球形或类球形；呼吸代谢，从不发酵代谢；可利用葡萄糖或其他糖产生少量酸或不产酸；接触酶阳性；细胞壁不含有消旋ニ氨基庚ニ酸和阿拉伯糖；专性好氧菌，通常生长在加生物素的简单培养基中，氧化代谢。最适 生长温度20 35°C ;节杆菌属菌种可应用于有机物污染的土壤修复、提高植物氮磷钾营养物质的吸收、可促进植物生长提高产量等。该菌属的部分菌种还可产生黄嘌呤氧化酶、脂肪酶、烟碱脱氢酶和谷胺酰胺合成酶，在エ业上有较高的应用价值。小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)又称立枯病、尖眼斑病,主要发生在世界各温带小麦区。病田病株率一般为10% -20%，轻者可减产5% -10%，重者减产20% -40%,并造成枯孕穗、枯白穗，更严重的是导致田区颗粒无收。防治小麦纹枯病主要采用化学防治技木，即喷洒农药，以三唑类药剂及井R霉素为主。然而，化学药剂虽能有效防治病害，但对小麦产量仍存在不同程度负面影响，且化学药剂的使用不可避免带来土壤环境的污染和药物残留问题。国内外关于节杆菌属菌株作为PGPR菌株，尤其是作为小麦纹枯病的生防菌株及其表现出的优良促生作用的研究几乎为空白，在菌株的作用机制及应用方面也比较落后，因此该菌属菌株的研究，尤以其促生防病潜能为开发和利用生物肥料及农药的理论和应用上的支持，具有深远的经济、社会、生态价值。
发明内容
本发明的目的在于提供ー株对植物具有生物防病和促生作用的滋养节杆菌及其应用。本发明提供的菌株Arl3于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 5853，分类名为滋养节杆菌(Arthrobacterpascens)。滋养节杆菌Arl3为革兰氏染色阳性，菌株Arl3在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)上培养。培养过程中有明显杆、球状周期变化。菌体长椭圆形，具有一根极生鞭毛，最适生长温度28°C，pH中性，其单菌落在NA培养基上为浅白色菌落，发亮白色光泽。本发明提供了含有滋养节杆菌Arl3的菌剂。进ー步,本发明提供了含有滋养节杆菌Ar 13的生物肥料。本发明提供滋养节杆菌Arl3或含有滋养节杆菌Arl3的菌剂和生物肥料在促进植物生长中的应用。本发明提供滋养节杆菌Arl3或含有滋养节杆菌Arl3的菌剂和生物肥料在抑制植物病原微生物中的应用。其中,所述的植物病原微生物为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、西瓜枯萎菌(Fusarium ox ysporum f. sp. niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia Iaxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和/成小长隊霉菌(Ceratocystis fimbriata)。本发明提供滋养节杆菌Arl3或含有滋养节杆菌Arl3的菌剂在制备植物促生剂中的应用。本发明提供滋养节杆菌Arl3或含有滋养节杆菌Arl3的菌剂在制备植物防病剂中的应用。 其中，所述的植物为绿豆、大豆和/或小麦。本发明提供了滋养节杆菌Arl3或含有滋养节杆菌Arl3的菌剂在制备生物肥料中的应用。本发明提供了以滋养节杆菌Arl3为有效成分的制剂在农业上的应用。
本发明提供的滋养节杆菌菌株Arl3对多种植物病原菌具有明显的抑制作用，同时对植物生长具有显著的促进作用，能够促进作物的生长和产量提高，对平板、温室小麦纹枯病的防治效果分别为94. 20%,46. 60% ;与清水相比使緑豆根伸长量、鲜重量，茎长伸长量分别增加297%、35. 3%,111% ;温室中对小麦、大豆的促生效果均高于井网霉素及植物生长素IAA-10_V g/ml稀释液。本发明提供的菌株Arl3及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，可广泛应用于植物病害生物防治和促生领域，具有较好的经济效益和社会效益。
图I为Arl3 16S rDNA PCR扩增结果，其中泳道I为电泳所用的Marker，泳道2为阴性对照，泳道3为Arl3菌株电泳結果。图2为Ar 13菌株的16S rDNA序列系统发育地位。图3为菌株Arl3在脱脂牛奶平板上产蛋白酶检測。图4为菌株Ar 13在CAS平板上产嗜铁素检测。图5为Arl3对小麦纹枯病平板防治效果图，其中A :小麦纹枯病菌；B :阴性对照；C :20*%井网霉素；D Ar 13圃液。图6为Arl3对小麦纹枯病温室防治效果图，其中A :小麦纹枯病囷；B :阴性对照；C :20*%井网霉素；D Ar 13圃液。图7为滋养节杆菌Ar 13在DF (+Trp)和DF (-Trp)液体培养基中的产IAA能力图，其中菱形表示Arl3菌株在DF(+Trp)中产IAA能力，三角形表示Arl3菌株在DF(-Trp)中产IAA能力。图8为滋养节杆菌Arl3对绿豆的促生效果图，其中从左向右处理依次编号为1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 ;其中 I :清水、2 =Ar13 菌液的 IAA 稀释液 10'3 :10べ、4 :10'5 10'6 :10'7 :10'8 :10'9 :10'10 :10'11 :10'12 =IO^1V g/ml 浓度。图9为滋养节杆菌Ar 13对温室盆栽大豆的促生效果图，其中A :IAA_10_V g/ml ；B Arl3 ；C :阴性对照(清水)。图10为滋养节杆菌Arl3对小麦的促生效果图，其中A :IAA-10_V g/ml ；B Arl3 ；C :阴性对照(清水)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I滋养节杆菌Arl3菌株的培养和鉴定I、菌株的分离和培养从中国农业大学桓台县华北集约化农业生态系统试验站小麦实验田中采集表层6cm土样,取5g的土溶解到在45ml无菌生理盐水的三角瓶中，28°C, 120rpm摇床震荡IOmin后静止lOmin，取100 u I的上清液加入到装有900 U I生理盐水的Eppendorf管中，进行连续梯度稀释。分别取以上土壤悬浮液和10_2，IO-3, IO-4倍土壤悬浮液稀释液100 Ul在NA培、养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)平板上均匀涂板，超净工作台内吹干，每个浓度重复3次，28°C温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化，将分离的菌株命名为Ar 13。2、菌株的鉴定I. I菌体形态特征革兰氏染色阳性，菌株Arl3培养过程中有明显杆、球状周期变化。菌体长椭圆形，具有一根极生鞭毛。I. 2生理生化特性将分离纯化的菌株Arl3进行生化试验，结果显示分离菌株为革兰氏阳性菌，严格好氧，其过氧化酶、氧化酶、葡萄糖氧化产酸产气、硝酸盐还原、果糖利用、a -半乳糖酶、明胶液化、卵磷脂酶均称阳性反应，淀粉水解、脲酶利用、反硝化、酯酶、精氨酸双水解、柠檬酸盐利用、酒石酸盐利用、VP測定均称阴性反应(见表I);可以利用D-半乳糖、松ニ糖、D-棉子糖、D-蜜ニ糖、D-果糖、D-甘露糖、a -环糊精、L-阿拉伯糖、糊精、吐温40、吐温80、a -D-葡萄糖、蔗糖、甲基丙酮酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、糖原、D-阿洛酮糖18种碳源，对こ酸、丙酸、甘油、赤藻糖醇等65种碳源不能利用，对纤维ニ糖、D-海藻糖、腺 苷等12种碳源的利用处于临界状态。表I、Ar 13生理生化特性
权利要求
1.滋养节杆菌(Arthrobacterpascens)菌株 Arl3,其保藏编号为 CGMCC No. 5853。
2.含有权利要求I所述滋养节杆菌Arl3的菌剂。
3.含有权利要求I所述滋养节杆菌Arl3的生物肥料。
4.权利要求I所述的滋养节杆菌Arl3或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在促进植物生长中的应用。
5.权利要求I所述的滋养节杆菌Arl3或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在抑制植物病原微生物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物病原微生物为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cereal i s)、西瓜ネ古妻菌(Fusarium ox ysporum f. sp. niveum ノ 、杉匕 1 腐病菌(Monilinia Iaxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和小长_霉菌(しeratocystis Iimbriataノ。
7.权利要求I所述的滋养节杆菌Arl3或权利要求2所述的菌剂在制备植物促生剂中的应用。
8.权利要求I所述的滋养节杆菌Arl3或权利要求2所述的菌剂在制备植物防病剂中的应用。
9.如权利要求4-8任一所述的应用，其特征在于，所述的植物为绿豆、大豆和/或小麦。
10.权利要求I所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂在制备生物肥料中的应用。
全文摘要
本发明提供了一株滋养节杆菌Ar13(Arthrobacter pascens)及其作为植物根际促生菌的应用。本发明的菌株Ar13保藏编号为CGMCC No.5853，该菌株及含有该菌株的菌剂具有促生防病的效果，能够促进作物的生长和产量提高，对平板、温室小麦纹枯病的防治效果分别为94.20％、46.60％；与清水相比使绿豆根伸长量、鲜重量，茎长伸长量分别增加297％、35.3％、111％；温室中对小麦、大豆的促生效果均高于井冈霉素及植物生长素IAA-10-8μg/ml稀释液。本发明提供的菌株Ar13及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，可广泛应用于植物病害生物防治和促生领域，具有较好的经济效益和社会效益。
文档编号C05F11/08GK102643766SQ20121010373
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者吴文良, 夏娜, 孙真, 李磊, 焦子伟, 郭岩彬 申请人:中国农业大学