专利名称：一种抑制牛肝菌菌丝体褐化的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种野生食用菌一广义美味牛肝菌(Boletus edulis s. I.)菌丝体的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于大型真菌菌丝体培养范畴。
背景技术：
牛肝菌属(Boletus)隶属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),为世界广布大属，该属主要分布于北半球，并集中于北极至赤道的温暖地区，在热带地区的马来西亚和南半球的哥伦比亚也有极少分布，目前数据库中记录的该属种类共有273个(含亚种，变种及类型)。中国的牛肝菌有5个属，其中可分辨的种类为129个左右，主要分布于云南、贵州、四川等西南地区。牛肝菌子实体体型较大、肉质肥厚、味道鲜美，是人类生活史中长期采食的一类美味食用真菌，另外，该属某些种类的子实体中还含有抗氧化、抗肿瘤等功能的特殊活 性物质，因而具有很高的经济价值和研究前景。牛肝菌为一类与植物共生的菌根真菌，其产量受到共生环境、产地气候、采集及保存方法等的严重限制，产量有限。目前，牛肝菌尚难以进行人工栽培，其子实体完全依赖野外采收。云南的自然资源丰富，野生牛肝菌产量大，但因近年气候变化、生态破坏等原因其自然产量已经严重下降且售价昂贵，难以走上大众餐桌，因此牛肝菌的人工驯化栽培仍然是科研工作者奋斗的终极目标。现在牛肝菌人工栽培的研究仍然存在很多问题，其中菌丝在人工培养基上生长极其缓慢、菌丝生长一段时间后，培养基及菌丝都容易褐化，影响后续生长，是影响菌丝体规模化繁殖的重要因素。广义的美味牛肝菌(5. edulis s. I.)指的是美味牛肝菌复合群(5. edulisComplex)中的种类，其形态学特征和分子标记与美味牛肝菌模式种十分相似。美味牛肝菌模式种为edulis Bull. :Fr.)，为牛肝菌科、牛肝菌属、牛肝菌组，其子实体中等至较大，菌盖直径4-15 cm,扁半球形或稍平展，黄褐色、土褐色或赤褐色，不粘，光滑，边缘钝；菌肉白色，受伤不变色，厚；菌管初期白色，后呈淡黄色，直生或近弯生；菌柄长5-12cm，粗2-3 cm，近圆柱形或基部膨大，淡褐色或淡黄褐色，内实，网纹占菌柄2/3 ;孢子印橄榄褐色，孢子淡黄色，平滑，近纺锥形，(10-15.2) um X (4.5-5.7) U m。牛肝菌子实体生于夏秋季，于林中地上单生或散生。牛肝菌菌丝可与多种树木形成外生菌根。美味牛肝菌在牛肝菌属中具有典型代表性，且在云南分布广泛。本发明以武定狮子山采集的一株广义美味牛肝菌子实体为材料，分离得到纯的菌丝，征对菌丝体培养过程中培养基及部分菌丝褐化、颜色加深等现象，重点进行培养基改良及优化，在促使菌丝快速生长的同时，保持菌落洁白、干净、清亮。这为牛肝菌菌丝体的规模化培养，人工或半人工驯化等奠定了重要基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单、成本低、能降低菌丝及培养基褐化程度、并能快速促进菌丝生长的培养方法。
实现本发明的技术方案以未开伞的子实体为材料，通过菌丝体诱导、菌丝体活化与均一性培养等途径进一步优化培养基，实现本发明的主要步骤如下
(1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
(2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；
(3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为:马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00 I. 30g/L、CaCl2 0. 80 I. 20g /L、KH2PO4O. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g /L、Vbi 0. 10 0. 30mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.13 0.20 g/L、琼脂10. 00 15. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养7-12天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，55-62天菌丝体基本长满培养基，但30-35天，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
(4)菌丝体活化与均一性培养将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过30-35天的暗培养(培养温度为22 23°C)，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每30-35天扩大培养一次；
(5)培养基改良及优化以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉 4. 00 8. 00 g/L，葡萄糖 0. 30 0. 50g /L，蛋白胨 4. 00 6. 00 g /L，MgSO4I. 00 I. 30g /L, CaCl2 0. 80 I. 20g /L, KH2PO4 0. 40 0. 60g /L, Vbi 0. 10 0. 30mg/L，谷氨酸0. 13 0. 20g/L，琼脂10. 00 15. 00 g/L, pH5. 40 5. 60)，使用该培养基，菌丝32-34天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。本发明的有益效果是采用比较简单的培养基，使菌丝在短期内快速增殖，而且菌丝的褐化程度降低，培养基清亮，其特点如下，
(1)培养基简单、生产成本低本发明所优化的培养基使用的几种成分都比较简单，以淀粉为碳源，以蛋白胨为氮源，除去了马铃薯及麦芽汁等，使培养基成分清晰、简单，减少了导致褐化的因素；
(2)周期短本发明克服了菌丝在固体培养基上生长速度缓慢、难以扩繁等问题，培养周期大大缩短。
具体实施例方式 以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实例一
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L、CaCl2L OOg /UKH2PO4O. 50g/L,NH4NO3 0. 40g/L> KNO3 0. 40g /L、VB1 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16 g/L、琼脂 13. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基，但30天后，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过30天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每30天扩大培养一次；
以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^ KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉5.00 g/L, 葡萄糖 0.50g /L，蛋白胨 4. 13g /L, MgSO4 I. 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 50g /L,Vbi 0. 10mg/L，谷氨酸0. 16g/L，琼脂10. 00g/L, pH5. 40)，使用该培养基，菌丝32天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。实例二
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 30g/L、CaCl2L 20g /UKH2PO4O. 60g/L,NH4NO3 0. 40g/UKNO3 0. 40g /L、VB10. 30mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 20 g/L、琼脂 15. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养8天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，55天菌丝体基本长满培养基，但32天后，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过33天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每32天扩大培养一次；
以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^ KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉6.00 g/L，葡萄糖 0.30g /L，蛋白胨 4. 00 g /L, MgSO4 I. 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 60g /L,Vbi 0. 30mg/L，谷氨酸0.2(^/1，琼脂15.00 g/L，pH5. 60)，使用该培养基，菌丝34天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。实例三
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 20g/L、CaCl2O. 80g /UKH2PO4O. 40g/L、NH4NO3 0. 40g/UKNO3 0. 40g /L、VB1 0.20mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 13g/L、琼脂 10. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养12天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，62天菌丝体基本长满培养基，但35天后，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过35天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每35天扩 大培养一次；
以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^ KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉8.00 g/L，葡萄糖 0.40g /L，蛋白胨 6. 00 g /L, MgSO4 I. 30g /L, CaCl2 I. 20g /L, KH2PO4 0. 40g /L,Vbi 0. 20mg/L，谷氨酸0. 13g/L，琼脂13. OOg/L, pH5. 50)，使用该培养基，菌丝33天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。实例四
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 10g/L、CaCl2L IOg /UKH2PO4O. 60g/L,NH4NO3 0. 40g/L> KNO3 0. 40g /L、VB1 0.25mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 18g/L、琼脂 12. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养10天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，58天菌丝体基本长满培养基，但34天后，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过32天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每31天扩大培养一次；
以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^ KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉4. 00g/L，葡萄糖 0.45g /L，蛋白胨 5. 00g /L，MgSO4 I. 20g /L, CaCl2 0. 80g /L, KH2PO4 0. 50g /L,Vbi 0. 10mg/L，谷氨酸0. 18g/L，琼脂12. OOg/L, pH5. 40)，使用该培养基，菌丝33天基本长 满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面(诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /UKH2PO4O. 50g/L,NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g /L、Vbi 0. 15mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 15g/L、琼脂 11. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)，培养温度为22 23°C，暗培养11天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，61天菌丝体基本长满培养基，但33天后，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿进行预实验(培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基)，经过34天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每33天扩大培养一次；
以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4NO3^ KNO3，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基(培养基为淀粉7.00 g/L，葡萄糖 0. 50g /L，蛋白胨 4. 13g /L, MgSO4 I. IOg /L, CaCl2 I. IOg /L, KH2PO4 0. 45g /L, Vbi0. 15mg/L，谷氨酸0. 17g/L，琼脂11.00 g/L，pH5. 40)，使用该培养基，菌丝32天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。权利要求
1.一种广义美味牛肝菌(Boletus edulis s. I.)菌丝体的培养方法,其特征为,采用未开伞的子实体诱导菌丝，针对菌丝体培养过程中培养基及部分菌丝褐化、颜色加深等现象，进行培养基改良及优化，使菌丝快速生长的同时，保持菌落洁白、干净、清亮，主要包括下列步骤 (1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体； (2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 3 0. 50cm2的小块； (3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为22 23°C，暗培养7-12天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，55-62天菌丝体基本长满培养基，但30-35天，随着培养时间的延长培养基颜色逐渐加深，部分白色菌丝也因褐色分泌物的产生而颜色加深； (4)菌丝体活化与均一性培养将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(预实验培养基)，经过30-35天的暗培养(培养温度为22 23°C )，培养皿中形成圆形规则菌落，用直径I cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每30-35天扩大培养一次; (5)培养基改良及优化以预实验培养基为基本培养基，去除葡萄糖、NH4N03、KN03，从碳源、氮源、C/N比例等方面对菌丝体的基本培养基进行了优化，得到了优化的培养基，使用该培养基，菌丝32-34天基本长满斜面试管，优化的培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。
2.根据权利要求I所述的美味牛肝菌菌丝体的培养方法，其特征在于步骤(3)中的诱导培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00 I. 30g/L、CaCl2 0. 80 I. 20g /L、KH2PO4O. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g /L、Vbi 0. 10 0. 30mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.13 0.20 g/L、琼脂10. 00 15. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右。
3.根据权利要求I所述的美味牛肝菌菌丝体的培养方法，其特征在于步骤(4)中的预实验培养基为去除了马铃薯和麦芽汁的诱导培养基。
4.根据权利要求I所述的美味牛肝菌菌丝体的培养方法，其特征在于步骤(5)中的优化培养基为淀粉4. 00 8. 00 g/L，葡萄糖0. 30 0. 50g/L，蛋白胨4. 00 6. 00 g /L，MgSO4 I. 00 I. 30g /L, CaCl2 0. 80 I. 20g /L, KH2PO4 0. 40 0. 60g /L, Vbi 0. 10 0.30mg/L，谷氨酸 0. 13 0. 20g/L，琼脂 10. 00 15. 00 g/L, pH5. 40 5. 60。
全文摘要
本发明涉及一种抑制牛肝菌菌丝体褐化的培养方法，属于生物技术领域(大型真菌培养)。牛肝菌目前仍难以人工栽培，其子实体完全依赖野外采收。近年由于气候变化、生态破坏等原因其自然产量已严重下降，价格昂贵。牛肝菌菌丝在人工培养基上生长缓慢、菌丝生长一段时间后，培养基及菌丝都容易褐化，影响后续生长。本发明以云南产的一株未开伞的美味牛肝菌子实体为材料，通过菌丝体诱导、菌丝体活化等途径，提供了一种能抑制或降低褐化的培养基，该培养基具有成分清晰、简单，成本低廉，菌丝体生长迅速，菌落白净等特点。这为牛肝菌菌丝体的规模化培养、人工或半人工驯化等奠定了重要基础。
文档编号A01G1/04GK102715013SQ201210201409
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者吴鹏, 周文, 张曦予, 李宗菊, 李彪, 王鹏飞 申请人:云南大学