一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法
【专利摘要】本发明属于植物生物【技术领域】，具体地，公开了一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法。所述方法改变了传统的麻疯树外植体再生不定芽的方法，即在诱导不定芽再生的培养基中不添加激素，而是利用高浓度的苯基噻二唑基脲溶液对各种来源的麻疯树外植体进行短期浸泡处理，给予外植体细胞短期但高强度的激素刺激，由此促使部分细胞以更高的效率直接再分化形成更多的不定芽。应用本发明所述方法可以显著提高麻疯树外植体不定芽的再生效率和质量。此外，本方法外植体无需经过常规的愈伤组织形成和不定芽增殖阶段，因此可显著缩短再生培养周期，使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提高。
【专利说明】一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】，具体地，涉及一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法。
【背景技术】
[0002]伴随着全球对化石燃料的需求日益增长，存储的化石燃料即将耗尽，人们越来越关注可再生的生物柴油。在可产生生物柴油的候选植物中，属于大戟科的麻疯树CZairoAacurcas L.)具有明显的优势，它的种子含油量高，种仁含油量可达40%飞0%，同时，麻疯树油中含有活性成分多，如毒蛋白、麻疯酮等有着重要的农药和医药价值。
[0003]然而，大力推广麻疯树的种植却面临一系列问题，虽然麻疯树种子中含油量高，但种子产量不高；种油中活性成分多，但仍需要改变油的成分才能直接替代化石燃料；麻疯树对环境要求较高，耐寒能力弱，分布区域较窄。麻疯树属包括175个种，可以通过种间杂交引入优良性状，但所需周期长，不能够获得特异的外源基因，故主要通过基因转化改变遗传背景。高频率的植株再生体系是基因转化的基础。
[0004]麻疯树外植体根据来源不同可以分为不同的类型。从成年麻疯树植株上直接获得叶片、叶柄经处理后可以得到成年植株叶片外植体、成年植株叶柄外植体。将麻疯树种子进行无菌培养得到的无菌苗，从无菌苗上得到无菌下胚轴、无菌子叶叶片和无菌子叶叶柄，经处理后可以得到无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体和无菌子叶叶柄外植体。将麻疯树种子经常规培育、萌发得到的萌发苗，从萌发苗上可以得到下胚轴和真叶叶柄，经处理后可以得到种子苗下胚轴外植体和真叶叶柄外植体。
[0005]现有技术中诱导麻疯树外植体再生不定芽时，通常是在麻疯树外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，浓度为2 mg/1 ;6-糠氨基嘌呤(6-KT)，浓度为0.1-1.0 mg/1或苯基噻二唑基脲(TDZ)，浓度为
0.05、.5 mg/1。在这种条件下叶柄外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。同时，这些再生体系均存在周期长(80 d以上)、再生率不高的问题，严重制约了麻疯树遗传转化研究的开展。
【发明内容】
[0006]本发明为了克服现有技术麻疯外植体再生不定芽时再生率低、再生芽体质量差、再生周期长的缺陷，提供一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法。所述方法简便，可以显著缩短整个培养周期，而且通过所述的方法可以得到数量更多、质量更好的不定芽。
[0007]本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，包括如下步骤:
51.获得麻疯树外植体；
52.将步骤SI中的麻疯树外植体用10-60mg/1苯基噻二唑基脲(TDZ)溶液浸泡处理5?40 min ；S3.将步骤S2处理后的麻疯树外植体以横放方式接种至无激素的培养基上培养；
所述横放方式为将外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直；
所述麻疯树外植体为成年植株叶片外植体、无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体、无菌子叶叶柄外植体、种子苗下胚轴外植体或真叶叶柄外植体。
[0008]麻疯树外植体根据来源不同可以分为不同的类型。从成年麻疯树植株上直接获得叶片、叶柄经处理后可以得到成年植株叶片外植体、成年植株叶柄外植体。将麻疯树种子进行无菌培养得到的无菌苗，从无菌苗上得到无菌下胚轴、无菌子叶叶片和无菌子叶叶柄，经处理后可以得到无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体和无菌子叶叶柄外植体。将麻疯树种子经常规培育、萌发得到的萌发苗，从萌发苗上可以得到下胚轴和真叶叶柄，经处理后可以得到种子苗下胚轴外植体和真叶叶柄外植体。
[0009]优选地，所述无菌下胚轴外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。
[0010]优选地,所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理40 min。
[0011]优选地，所述无菌子叶叶柄外植体或真叶叶柄外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。
[0012]同时，发明人在前期研究工作中发现:从成年麻疯树植株上获得的成年植株叶柄外植体最适合的处理方式为用3 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理5 min,不定芽的再生效果最好。本发明同时也发现:而种子苗下胚轴外植体不适宜采用苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理的方法来诱导不定芽再生。由此可以看出:不同类型的麻疯树外植体的细胞的分裂能力各异，不同类型的麻疯树外植体对TDZ的敏感性也不同，决定了其再生不定芽的难易程度不同，所以，不是所有类型的麻疯树外植体都可以采用这种方法来诱导不定芽再生。
[0013]优选地，所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体在以横放方式接种至无激素的培养基上培养时，采用叶片下表面朝上的接种放置方式，其不定芽的再生效果比较好。所谓叶片下表面朝上的接种放置方式就是说让叶片的上表面紧贴培养基表面，叶片下表面朝上。
[0014]步骤S2的TDZ溶液采用一般方法配制成所需即可，具体地，可以采用如下方法配制:称取一定量的TDZ粉末，用lmol/1 NaOH充分溶解，再用去离子水定容，采用I mol/1HCl溶液调整TDZ处理溶液的pH至5.8飞.0 ;使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的TDZ处理溶液进行过滤灭菌。
[0015]所述不同类型的麻疯树外植体的制备方法可以参考本【技术领域】常规方法得到即可。
[0016]优选地，步骤S3中所述培养的条件为:光照强度为200-2500 lx，光照时间为12-16小时/天，培养温度为25±1°C。
[0017]本发明的创造点在于先用高浓度的激素短暂处理，再用无激素的培养基培养再生不定芽，无激素培养基的种类对本发明来说不是着重点，只要是不含激素，而且能够为不定芽的再生提供充足营养成分的培养基都可以实现本发明。优选地，本发明步骤S3中所述无激素的培养基以无激素的MS培 养基为主要成分。另外，所述无激素的培养基还含有25-35g/Ι蔗糖、8(Tl20 mg/1肌醇和6-8 g/Ι琼脂；培养基pH为5.8-6.0。所述培养基并不限定本发明的保护范围。[0018]传统麻疯树外植体不定芽再生培养方法之所以存在不定芽再生效率很低，芽体的质量差、周期长的缺陷，首先是因为长时间培养外植体不能够用高浓度的细胞分裂素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的细胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不够强。其次是在不定芽形成以后残存在培养基和外植体组织中的细胞分裂素对不定芽的进一步生长有十分不利的影响。
[0019]本发明对通常的麻疯树外植体不定芽再生培养方法进行了创新，即在诱导不定芽再生培养基中都不添加TDZ，取而代之的是利用高浓度的TDZ溶液对麻疯树外植体进行短期的浸泡处理，给予外植体具有分化能力的细胞相对于普通添加TDZ的培养基更强的刺激，诱导形成更多的不定芽。同时，由于仅是局部短时的浸泡处理，TDZ在细胞中的浓度随后很快降低，减少了在培养后期对所形成的不定芽的发育的负面影响，可以达到一次培养操作就可以得到完整植株的高效目的。
[0020]本发明的发明人在前期工作中只研究了高浓度苯基噻二唑基脲短期处理方法促进成年植株叶柄外植体不定芽再生的效果。但是，后来经过大量的创造性试验发现:不同类型的麻疯树外植体的细胞的分裂能力各异，不同类型的麻疯树外植体对TDZ的敏感性也不同，决定了其再生不定芽的难易程度不同，所以，不是所有类型的麻疯树外植体都可以采用这种方法来诱导不定芽再生。
[0021]本发明的有益效果:
本发明所述麻疯树外植体直接再生不定芽的方法简便，可以显著缩短整个培养周期，传统方法的再生周期为80天以上，而本方法只需70天；通过本发明所述的麻疯树外植体直接再生不定芽的方法可以得到数量更多、质量更好的不定芽，现有方法的不定芽再生率一般为16.08 9-55.11 %，而采用本发明的方法的不定芽再生率为75.67 9-92.98 %。
[0022]说明书附图
图1.不同浓度的TDZ溶液处理无菌下胚轴外植体20分钟后不定芽再生培养35天的效果；A: 10 mg/1 ；B:20 mg/1 ；C:30 mg/1 ；D:60 mg/1 ；bar =1 cm。
[0023]图2.无菌下胚轴外植体再生不定芽在伸长培养基上培养15天后的效果；A:再生不定芽在伸长培养基中的生长效果图；B:将再生不定芽从伸长培养基中取出来的效果图；bar =1 cm。
[0024]图3.采用20 mg/1 TDZ溶液浸泡处理2种类型下胚轴外植体20 min后以两种方式接种至不定芽再生培养基上培养35天后的效果；A:无菌下胚轴外植体横放方式；B:无菌下胚轴外植体竖插方式；C:种子苗下胚轴外植体横放方式；D:种子苗下胚轴外植体竖插方式；bar =1 cm。
[0025]图4.采用20 mg/1的TDZ溶液浸泡处理2种类型叶柄外植体20 min后以两种方式接种至不定芽再生培养基上培养35天后的效果；A:真叶叶柄外植体横放方式；B:真叶叶柄外植体竖插方式；C:无菌子叶叶柄外植体横放方式；D:无菌子叶叶柄外植体竖插方式；bar =1 cm。
[0026]图5.2种类型叶柄外植体再生不定芽在伸长培养基上培养15天后的效果；A、B:真叶叶柄外植体再生不定芽伸长效果；C、D:无菌子叶叶柄外植体再生不定芽伸长效果；bar =1 cm。
[0027]图6.采用20 mg/1 TDZ溶液浸泡处理2种类型叶片外植体40 min后以两种方式接种至不定芽再生培养基上培养35天后的效果；A:成年植株叶片外植体上表面朝上，B:成年植株叶片外植体下表面朝上；C:无菌子叶叶片外植体上表面朝上；D:无菌子叶叶片外植体下表面朝上；bar =1 cm ο
[0028]图7.无菌子叶叶片外植体再生不定芽在伸长培养基上培养15天后的效果图；bar=1 cm。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
[0030]实施例1:
S1.对外植体进行短期细胞分裂素溶液处理的容器的准备
选取直径为9 Cm的有盖培养皿，置于高压蒸汽灭菌锅中，在121°C，0.1 MPa的条件下灭菌20 min。
[0031]S2.苯基噻二唑基脲(TDZ)处理溶液的配制。
[0032]准确称取一定量的TDZ粉末，用I mol/1 NaOH溶液充分溶解，再用去离子水定容，配制成0、10、20、30、40、50、60 mg/1的TDZ处理溶液(对照组O mg/1 TDZ溶液为无菌去离子水)。采用I mol/1 HCl溶液调整TDZ处理溶液的pH至5.8飞.0 ;使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的TDZ处理溶液进行过滤灭菌。
[0033]S3.麻疯树无菌下胚轴外植体的获取 将浸泡了 2天的麻疯树种子去壳，经过0.1%升汞溶液灭菌后，在超净工作台中用无菌手术刀剥离胚胎，将剥离的胚胎接种至经过高温蒸汽灭菌的MS培养基(MS配方成分+30 g/I蔗糖+100 mg/1肌醇+6 g/Ι琼脂；pH5.8-6.0)上，培养12天后，获取种子苗上的下胚轴，用无菌手术刀将下胚轴切成长度约为0.5 cm的下胚轴切段，即可作为无菌下胚轴外植体。
[0034]S4.细胞分裂素(TDZ)溶液处理麻疯树种子苗下胚轴外植体
在超净工作台中，把切好的无菌下胚轴外植体分别置于上述步骤Si准备好的灭过菌的培养皿中，向各个培养皿中分别倒入上述步骤S2配置的各个浓度的TDZ处理溶液至浸没叶柄外植体为止，盖上培养皿盖，静置20 min后，倒掉TDZ溶液，保留无菌下胚轴，用灭过菌的镊子从培养皿中取出所有的无菌下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去无菌下胚轴外植体表面多余的水分，每个浓度的TDZ溶液分别有3个平行处理。
[0035]S5.将切好的无菌下胚轴外植体置于细胞分裂素(TDZ)溶液处理的容器中，向该容器的广口玻璃瓶中倒入不同浓度的TDZ溶液(O、10、20、30、60 mg/1)至浸没所有的无菌下胚轴外植体为止(对照组O mg/1 TDZ溶液为无菌去离子水),盖上瓶盖,静置20 min后，倒掉TDZ溶液，保留下胚轴，用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的无菌下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去下胚轴外植体表面多余的液体，最后把处理后的无菌下胚轴外植体以横放方式(将下胚轴外植体放置在培养基上，使下胚轴外植体与培养基表面轻轻接触，并且使下胚轴外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直)接种在无激素MS培养基(MS配方成分+30 g/Ι蔗糖+100 mg/1肌醇+6 g/Ι琼脂；ρΗ5.8?6.0)上培养35天，所获得实验结果如表I和图1所不。
表I不同浓度的TDZ溶液浸泡处理麻疯树无菌下胚轴外植体诱导不定芽直接再生的效果
【权利要求】
1.一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.获得麻疯树外植体； 52.将步骤SI中的麻疯树外植体用10-60mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理5?40min ； 53.将步骤S2处理后的麻疯树外植体以横放方式接种至无激素的培养基上培养； 所述横放方式为将外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直； 所述麻疯树外植体为成年植株叶片外植体、无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体、无菌子叶叶柄外植体或真叶叶柄外植体。
2.根据权利要求1所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，所述无菌下胚轴外植体用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。
3.根据权利要求1所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理40min。
4.根据权利要求1所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，所述无菌子叶叶柄外植体或真叶叶柄外植体用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。
5.根据权利要求3所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体在以横放方式接种至无激素的培养基上培养时，采用叶片下表面朝上的接种放置方式。
6.根据权利要求1所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，S3中所述培养的条件为:光照强度为2000?2500 lx，光照时间为12?16小时/天，培养温度为25±1°C。
7.根据权利要求1所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，S3中所述无激素的培养基以无激素的MS培养基为主要成分。
8.根据权利要求7所述一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，所述无激素的培养基还含有25?35g/l蔗糖、8(Tl20 mg/1肌醇和6?8g/l琼脂；培养基pH为·5.8?6.0。
【文档编号】A01H4/00GK103430841SQ201310333563
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】刘颖, 杨跃生, 刘振兰, 庄楚雄, 李静, 童欣, 惠文凯, 陈晓阳 申请人:华南农业大学