兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法
【专利摘要】兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，涉及植物组织培养方法。本发明选取水培苗的茎段为外植体，用酒精和升汞处理后接种在茎芽系诱导培养基中，进一步将茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，并在生根培养中取IBA浓度2.0mgL-1，生根率高于85%。上述取水培苗作为来源，其污染率和褐化率明显低于温室培育苗；用酒精和升汞消毒相互促进；茎芽系诱导、增殖与正交实验结果一致；IBA对生根的影响为单因素随机区组实验的结果。
【专利说明】兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的栽培方法，特别是涉及植物组织培养方法。
【背景技术】
[0002]蓝莓是ー种重要的经济林木，果实深蓝色，果肉细腻，风味独特，被誉为“水果皇后”，“美瞳之果”，被国际粮农组织列为五大健康食品之一。蓝莓具有一定的营养价值和药用价值，果肉富含维生素、蛋白质和矿物质等营养元素(Debnath & McRAE, 2001 ；Debnath,2005)。兔眼蓝莓{Vacciniutn ashe1.)属杜醇花科越桔属多年生落叶灌木(Vander, 1988;Ratnaparkhe, 2007)。Lohachoompol (2008)认为兔眼蓝莓花青苷含量显著高于高丛蓝莓，丰富的花青苷色素可以缓解眼睛疲劳、改善人的视力。兔眼蓝莓较其它蓝莓长势更强，抗病又抗旱(Powell et al，1989)，且较其它蓝莓产量高。除了作为ー种水果食用外，兔眼蓝莓正在被开发成果酱、饮料等多种形式(Su & Silva，2006)，人们对蓝莓的需求越来越大形成了良好的市场前景，从而带动了大量优质蓝莓品系的扩繁和栽培(Scherm & Krewer, 2003 ；Strik & Yarborough, 2005)。
[0003]蓝莓的繁殖方式主要为扦插和组培，扦插育苗存在时间限制，而组织培养是无性系快繁、种质改良和遗传资源保存的重要方式之一(Debnath，2007)，具有周期短、不受季节和时间的限制及繁埴系数高等特点(Yin & Wang, 2009)。据报道(Cao & Hammerschlag,2000;Debnath, 2004):蓝莓的组培途径分为茎芽系微繁和愈伤增殖两种方式。蓝莓的增殖培养，影响增殖的主导因素有ZT、TDZ和2iP。Debnath和McRAE(2001)在canberry增殖培养中，使用 2.5mg/L 2iP综合效果最佳。在bilberry (Shibli 和 Smith, 1996) >Iingonberry(Debnath, 2005)和 highbush blueberry (Cao 和 Hammerschlag, 2000)增通培养中，使用1.lmg/L TDZ 综合效果最佳。在 half-highbush blueberry (Zhao 等，2011)的增埴培养中，使用 5mg/L ZT 综合效果最佳。在 lowbush blueberry (Debnath, 2004 ；2009)的增值培养中，使用0.9mg/L ZT综合效果最好。蓝莓的生根方式有瓶内生根和体外生根两种。目前，在 bilberry (Shibli 和 Smith, 1996)、lowbush blueberry (Debnath, 2004)和 lingonberry(Debnath, 2005)体外生根培养中，使用IBA生根粉综合效果最佳。在half-highbushblueberry (Zhao等，2011)的瓶内生根培养中，使用2mg/L IBA综合效果最佳。同时,在蓝莓无菌培养系建立过程中，鲜有关于取材来源对消毒效果影响的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明g在通过对兔眼蓝莓组织培养的各步骤研究，包括外材来源、外植体消毒、ZT、NAA和栽培品种对茎芽系増殖、IBA对生根培养的影响，提供一种兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，建立其优良品系。
[0005]本发明通过以下方式实现兔眼蓝莓的构建方法的目的:
构建方法包括茎芽系诱导培养、茎芽系増殖培养、生根培养，其中:
选取水培苗的茎段为外植体，先用70%的酒精处理20seC，再用0.1%的升汞处理18min，然后接种在茎芽系诱导培养基中，该培养基组合为WPM+1.0 mgじ1ZT +5g/LAgar+30g/L Sucrose。
[0006]所述的构建方法是将兔眼蓝莓茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系増殖培养中，该培养基组合为 WPM+2.0 IngL1ZT +0.01 IngL1NAA +5g/L Agar+30g/L Sucrose,综合表现最佳。
[0007]所述的构建方法是在兔眼蓝莓组培的生根培养中，该培养基组合为l/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA 浓度 2.0mgじ1 IBA 对生根培养综合表现最好,生根率高于85%。
[0008]本发明具有的积极效果和意义是:
本发明在兔眼蓝莓无菌培养系建立过程中，选取水培苗和温室培育苗作为来源，对取材来源与消毒效果影响进行对比，结果表明:取水培苗作为来源，其污染率和褐化率明显低于温室培育苗。而在相同来源外材的条件下，最佳的茎段消毒体系为取水培苗茎段，先用70%酒精处理20s，然后用0.1%升汞处理18min。在此过程中，升汞的效应大于酒精，而且两者之间有交互作用，即酒精和升汞对消毒会产生相互促进的效果。这与Debnath(2004)、Debnath (2005)和Zhao等(2011)的观点不一致。出现这种情况的可能原因有:⑴兔眼蓝莓与其它蓝莓物种不同，茎段消毒体系有所差异；(2)酒精増加茎段表面的透性，提高升汞对外材的消毒效果；(3)水培苗相对温室苗而言，整体的污染度会降低。
[0009]在兔眼蓝莓茎芽系增殖培养中，2.0mg/L ZI^P0.01mg/L NAA的综合表现最佳。其中，品种间遗传差异是影响株高的主导因素；ZT是影响叶片数量及长度、增值倍数的主导效应，且以2.0mg/L的浓度表现最佳。后者区别于已知的影响蓝莓増殖的主导因素中选择的 5mg/L ZT 最佳综合效果(half-highbush blueberry, Zhao 等，2011),以及在 lowbushblueberry (Debnath, 2004 ；2009)的增值培养中，使用0.9mg/L ZT得到最好综合效果的文献记载。
[0010]本发明在兔眼蓝莓生根培养中，2.0mgL 1IBA对蓝莓生根培养综合表现最佳，生根率大于85%。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图f 4是本发明涉及的兔眼蓝莓在增值培养中，叶片数与长度、株高和增值倍数随各因素水平极差变化图。其中，
图1为株高在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。
[0012]图2为叶片数量在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。
[0013]图3为叶片长在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。
[0014]图4为增值倍数在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。
[0015]图5~图10为兔眼蓝莓组培苗的无菌培养系各阶段示意图。其中，
图5为兔眼蓝莓组培苗的无菌培养系示意图。
[0016]图6为兔眼蓝莓‘Brightwell’茎芽系的增殖示意图。
[0017]图7为兔眼蓝 莓‘Premier’茎芽系的增殖示意图。
[0018]图8为兔眼蓝莓‘Garden Blue’茎芽系的增殖示意图。
[0019]图9为兔眼蓝莓组培苗生根培养示意图。[0020]图10为兔眼蓝莓组培苗移栽驯化。
[0021]以下结合【具体实施方式】对本发明对进ー步说明。本发明包括但不限于实施方式记载的内容。
【具体实施方式】
[0022](一)以L18(2 X 37)考査酒精和升汞对水培兔眼蓝莓幼茎段消毒的影响
培养基组合选用l/2MS+5g/L Agar+30g/L Sucrose,调节pH至5.8分装至SigmaChemical C0.的175mL塑料盖玻璃瓶，121 °C灭菌20min。外植体选用‘Brightwell’、‘Premier’、‘Garden Blue’之3种兔眼蓝莓水培的和大田中的当年生幼茎段，采自西南林业大学试验田。用0.1%的洗洁精浸泡叶片lmin，然后用流水冲洗2h，置于超净工作台上，采用L18(2X37)正交实验研究70%酒精和0.1%升汞对外植体消毒的影响，接着用无菌水浸泡3次，毎次5min。将单芽茎段插于培养基上。实验重复3次，每个重复设18个处理组合，每个处理组合接种30个外植体，如表1。在培养架上摆放采用随机区组实验设计，光照16h/d，培养7d后，记录数据，结果表明:使用水培苗的茎段，先用70%的酒精处理20sec，再用0.1%的升萊处通18min,污染率最低,活性最闻。
[0023]表1幼茎段消毒水平和參数
【权利要求】
1.兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，包括茎芽系诱导培养、茎芽系増殖培养、生根培养，其特征是选取水培苗的茎段为外植体，先用70%的酒精处理20seC，再用0.1%的升汞处理18min，然后接种在茎芽系诱导培养基中，该培养基组合为WPM+1.0 mg.じ1ZT +5g/LAgar+30g/L Sucrose。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是将兔眼蓝莓茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，该培养基组合为WPM+2.0 mg?じ1ZT +0.01 mg.じ1NAA +5g/LAgar+30g/L Sucrose,综合表现最佳。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征是在兔眼蓝莓组培的生根培养中，该培养基组合为 l/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA浓度 2.0mg.じ1 IBA对生根培养综合表现最好，生根率闻于85%。
【文档编号】A01H4/00GK103583368SQ201310592650
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】张太奎, 刘小珍, 张汉尧 申请人:西南林业大学