一种羊肚菌优质菌种的生产工艺的制作方法
【专利摘要】一种羊肚菌优质菌种的生产工艺，包括羊肚菌的采集时间、优质菌株的筛选、菌丝的培养、母种的制作及培养、栽培种的制作及培养。于种植羊肚菌第二年的2月～3月，第一茬或第二茬羊肚菌出菇后的第7～10天，10cm≤羊肚菌个体长度≤15cm，菌盖饱满，菌盖上棱和凹坑完全展开,菌柄为乳白色时采集，优质菌株的筛选采用菌盖形态及颜色筛选、菌柄颜色及形态筛选、孢子颜色及数量筛选、菌核生成能力筛选四级逐级淘汰筛选。本发明生产的羊肚菌优质菌种连续三年鲜菇产量平稳，稳定在80kg左右，出菇时间稳定、个体生长速度相接近，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。
【专利说明】一种羊肚菌优质菌种的生产工艺【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种羊肚菌优质菌种的生产工艺。
【背景技术】
[0002]羊肚菌又名羊肚菜，美味羊肚菌、羊蘑，因其外表酷似羊肚而得名，系子囊菌亚门(Ascomy-cotina)，盘菌纲iDiscomycetes、,盘菌目iPezizales、羊肚菌科(.Morchellaceae),羊肚菌属(Morchel-1a)。羊肚菌在我国分布比较广泛，但每个地区的羊肚菌种类资源丰富度不同，而且还有很大差异。迄今为止，已报道的羊肚菌有29种，在中国分布的羊肚菌种类有15种，云南有4种:黑脉羊肚菌、尖顶羊肚菌、高羊肝菌和羊肝菌，分布在昆明、大理、丽江、中甸、昭通、曲靖等地州市海拔1000-3000米地域，是中国羊肚菌主要产区之一。传统医学证明:羊肚菌性平，味甘寒，无毒；有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾壮阳、补脑提神等功效。此外，羊肚菌其味道鲜美，因此备受国内外青睐。[0003]野生羊肚菌在云南省丽江市的分布比较广泛，主要分布于石头乡、九河乡和鲁甸乡。但由于近年来羊肚菌价格的不断攀升，导致羊肚菌野生资源的不断采集，现在羊肚菌原野生产地已很难再采集到羊肚菌，因此，羊肚菌仿生栽培已迫在眉睫。从2006年起，云南省农业科学院高山经济植物研究所开展了羊肚菌菌种的采集及栽培试验，试验已获得了成功，亩产鲜品羊肚菌60kg左右，但随后我们发现羊肚菌每年的产量是不稳定的，我们对2006-2008年种植的MOOl羊肚菌进行了产量评估，2006年羊肚菌亩产量为62.57kg，2007年羊肚菌亩产量为54.32kg, 2008年羊肚菌亩产量为49.51kg, 2007年和2008年亩产量分别比2006年亩产量下降了 13.19%和20.87%，我们对此做了相关研究，研究发现，羊肚菌的稳产除与自然条件和管理有关外，与菌种的优劣有着直接的关系，例如菌株的采集时间及羊肚菌的外观形态、母种及栽培种的品质等。因此，要保持羊肚菌的稳定高产必须以优质的菌种作为前提。本发明提供了一种羊肚菌优质菌种的生产工艺，旨在规范羊肚菌优质菌种生产方法，为解决羊肚菌生产过程中产量不稳定提供重要技术支撑。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种羊肚菌优质菌种的生产工艺，以解决了目前羊肚菌产量不稳定的技术问题。
[0005]本发明所提供一种羊肚菌优质菌种的生产工艺，包括以下步骤:
(I)羊肚菌的采集时间
于种植羊肚菌第二年的2月~3月，第一茬或第二茬羊肚菌出菇后的第7~10天，IOcm <羊肚菌个体长度< 15cm,菌盖饱满,菌盖上棱和凹坑完全展开，菌柄为乳白色时采集无病虫害的羊肚菌菌株；
(2)优质菌株的筛选，按如下四级进行逐级淘汰筛选:
①菌盖形态及颜色筛选
菌盖长度>4 cm,2 cm <菌盖最宽处的宽度< 5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
②菌柄颜色及形态筛选
将步骤(2)①未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度> 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
③孢子颜色及数量筛选
A.孢子的收集，将洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(2)②未淘汰的羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的顶部朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到羊肚菌孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级；
B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数< IO2个的为二级，淘汰第二级；
④菌核生成能力筛选
无菌条件下，挑取少量步骤(2)③B未淘汰的羊肚菌的菌株孢子放入IOml无菌水中，摇匀得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，250C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取1.0cmX 1.0cm菌块接入PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量，菌丝生长速度> 6.4mm/d、菌核数量> 40个、菌核生成时间< 7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为羊肚菌优质菌株；
(3)菌丝的培养
将PDA培养基高压灭菌后，冷却到50-60°C，在无菌条件下，取15ml PDA培养基倒入平板中冷却凝固后，备用；用接种针挑取少量步骤(2)④获得的羊肚菌优质菌株的孢子放入IOml无菌水中，摇匀，得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，25°C暗培养，待长满平皿后备用；
(4)母种的制作及培养
①母种培养基的配制:将浸泡48小时的小麦煮熟后捞出，在煮熟的小麦中加入鹿糖和麦麸，鹿糖的加入量为煮熟的小麦质量的0.1%,麦麸的加入量为煮熟的小麦质量的0.2%,拌匀并控制含水量为30%即得母种培养基；
②母种的制作及培养，将配制的母种培养基装入300ml的聚丙烯培养瓶中，装入的母种培养基量为聚丙烯培养瓶体积的2/3，再将聚丙烯培养瓶在126°C，压力0.15Mpa的条件下灭菌Ih后冷至室温；在无菌条件下，每聚丙烯培养瓶接入IcmX Icm的步骤(3)培养的菌丝后，置于25°C培养箱中，在100 1x光照下培养，待菌丝长满聚丙烯培养瓶后，转入15°C培养箱中暗培养10~15d ；
(5)栽培种的制作及培养
①栽培种培养基的配制:以质量分数计，用木屑为78%，麦麸为20%，蔗糖为1%，石灰为
0.1%，磷酸二氢钾为0.1%，浸泡48小时的小麦为0.8%混合拌匀并控制含水量为30%即得栽
培种培养基；
②栽培种的制作及培养:将配制的Ikg栽培种培养基装入规格为17cmX33cm的聚丙烯袋中，边装边压实，使栽培种培养基体积为聚丙烯袋体积的2/3，用玻璃丝扎口并留缝隙，再将聚丙烯袋在121~126°C，压力0.12~0.15Mpa的条件下灭菌1.5h后，冷却至室温，备用；将步骤(4)②培养的母种接入所述的装有栽培种培养基并经灭菌冷却至室温的聚丙烯袋中，25°C下培养20-30d，菌丝长满菌袋后，转入室温下继培养10-15d，每聚丙烯袋中母种接入量为10g，栽培种培养基四周长满金黄色菌核时，即得到羊肚菌优质菌种。
[0006]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
将本发明生产工艺生产的羊肚菌优质菌种按传统农田栽培模式(传统农田栽培模式是指在农田中，利用圆叶杨为菌材种植羊肚菌的方法)进行种植，进行连续三年产量评估，2011年、2012年、2013年连续三年鲜菇产量分别达到83.52kg,79.95kg,81.74kg，连续三年的出菇时间分别为2011年2月26日、2012年2月29日、2013年2月28日，连续三年个体长度分别为8~12cm、6~13cm、5~IOcm,因此,本发明方法生产的羊肚菌优质菌种连续三年鲜菇产量平稳，连续三年鲜菇产量稳定在80kg左右，各年产量相差最大不到5%、出菇时间稳定、个体生长速度相接近，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是尖顶羊肚菌菌株个体各部位尺寸测量示意图。图中各标记依次表示:1 一尖顶羊肚菌菌盖，2—尖顶羊肚菌菌柄，L表示菌株个体长度，LC表示菌盖长度，WC表示菌盖最宽处的宽度，WS表示菌柄最窄处的宽度。
【具体实施方式】
[0008]参见图1，菌株个体长度:从菌株菌盖的顶端外缘至菌株菌柄的底端外缘的长度L为菌株个体长度。
[0009]菌盖长度:从菌株菌盖的顶端外缘至菌株菌盖的底端外缘的长度LC为菌盖长度。
[0010]实施例1本发明方法 1、羊肚菌的采集时间
栽培的羊肚菌的采集时间一般在每年2月-6月之间，在此期间，羊肚菌会不断地出菇，第一茬和第二茬(2月~3月)的羊肚菌个大，形态好，显微镜下观察，羊肚菌的孢子形态椭圆形，活力强，因此，采集羊肚菌的最佳时间在第一茬或第二茬羊肚菌出菇后的第7-10天，IOcmS羊肚菌个体长度< 15cm，菌盖饱满，无病虫害，菌柄乳白色，菌盖棱和凹坑完全展开，此时孢子进入成熟期，且还未弹射孢子，此时是采集羊肚菌的最佳时期；种植羊肚菌一般是每年的8月-10月。因此，于种植羊肚菌后的第二年的2月~3月，第一茬或第二茬羊肚菌出菇后的第7~10天，1Ocm <羊肚菌个体长度< 15cm，菌盖饱满，菌盖上棱和凹坑完全展开，菌柄为乳白色时是采集羊肚菌的最佳时期，采集时需采集全株无病虫害的羊肚菌菌株。
[0011]本实施例于2010年2月，在云南省丽江市玉龙县石头乡随机采集的尖顶羊肚菌CM.conica)20株，采集第一茬是2月出菇后第8天，编号为M001、M002….M010，第二茬是2月出菇后第18天编号为M011、M012….M020，所采集的尖顶羊肚菌的IOcm <羊肚菌个体长度L ( 15cm、菌盖饱满、菌盖上棱和凹坑完全展开、菌柄为乳白色、全株无病虫害。
[0012]2、优质菌株的筛选，按如下四级进行逐级淘汰筛选:
①菌盖形态及颜色筛选
将步骤I采集的菌株进行菌盖形态及颜色的比较，菌盖长度LC > 4 cm,2 cm <菌盖最宽处的宽度WC ( 5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级,其余为二级,淘汰第二级；
结果:
一级尖顶羊肚菌菌株共有13株，分别是:
M002、M003、M004、M005、M007、M008、M009、M010、M011、M012、M015、M018、M020。
[0013]二级尖顶羊肚菌菌株有7株，分别是:
M001、M006、M013、M014、MO 16, M017、M019。
[0014]②菌柄颜色及形态筛选
将步骤(2)①未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度WS > 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
结果:
初选一级尖顶羊肚菌菌株8株，分别是:
M002、M004、M005、M008、MO 10、MO 11、MO 12、M020。
[0015]初选二级尖顶羊肚菌菌株5株，分别是:
M003、M007、M009、M015、M018。
[0016]一级尖顶羊肚菌菌株 6 株，分别是:M002、M005、M008、M010、M012、M020。
[0017]二级尖顶羊肚菌菌株2株，分别是:M004、M011。
[0018]③孢子颜色及数量筛选
A.孢子的收集，将洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(2)②未淘汰的羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的顶部朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到羊肚菌孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级；
B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数< IO2个的为二级，淘汰第二级；
结果:一级菌株有 4 株:M002、M005、M010、M012。
[0019]二级菌株有2株:M008、M020，淘汰第二级。
[0020]④菌核生成能力筛选
无菌条件下，分别挑取少量经步骤2③B未淘汰的尖顶羊肚菌的M002、M005、M010、M012菌株孢子分别放入IOml无菌水中，摇匀，分别得到四种孢子母悬液，每种孢子母悬液按如下操作:
取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入新配的PDA培养基中，25°C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取
1.0cmX 1.0cm菌块接入新配的PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量,菌丝生长速度> 6.4mm/d、菌核数量> 40个、菌核生成时间(7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为羊肚菌优质菌株。
[0021]结果: 一级菌株有I株:MO 12。
[0022]二级菌株有3株:M002、M005、M010，淘汰第二级。
[0023]3、菌丝的培养
将PDA培养基高压灭菌后，冷却到50-60°C，在无菌条件下，取15ml PDA培养基倒入平板中冷却凝固后，备用；用接种针挑取步骤2④获得的羊肚菌优质菌株M012的孢子放入IOml无菌水中，摇匀，得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入新配的PDA培养基中，25°C暗培养，此时得到的菌丝为单孢子菌丝，待长满平皿后备用；
4、母种的制作及培养
①母种培养基的配制:将浸泡48小时的小麦煮熟后捞出，在煮熟的小麦中加入鹿糖和麦麸，鹿糖的加入量为煮熟的小麦质量的0.1%,麦麸的加入量为煮熟的小麦质量的0.2%,拌匀并控制含水量为30%即得母种培养基；
②母种的制作及培养，将配制的母种培养基装入300ml的聚丙烯培养瓶中，装入的母种培养基量为聚丙烯培养瓶体积的2/3，再将聚丙烯培养瓶在126°C，压力0.15Mpa的条件下灭菌Ih后冷至室温；在无菌条件下，每聚丙烯培养瓶接入IcmX Icm的步骤3培养的菌丝后，置于25V培养箱中，在100 Ix光照下培养，待菌丝长满聚丙烯培养瓶后(10天后菌丝长满菌瓶)，转入15°C培养箱中暗培养IOd ;羊肚菌菌核大量生成，并布满整瓶，菌核质地坚硬，金黄色。
[0024]5、栽培种的制作及培养
①栽培种培养基的配制:以质量分数计，用木屑为78%，麦麸为20%，蔗糖为1%，石灰为
0.1%，磷酸二氢钾为0.1%，浸泡48小时的小麦为0.8%混合拌匀并控制含水量为30%即得栽
培种培养基；
②栽培种的制作及培养:将配制的Ikg栽培种培养基装入规格为17cmX33cm的聚丙烯袋中，边装边压实，使栽培种培养基体积为聚丙烯袋体积的2/3，用玻璃丝扎口并留缝隙，以防止高压下涨袋，再将聚丙烯袋在121~126°C，压力0.12~0.15Mpa的条件下灭菌1.5h后，冷却至室温，备用；将步骤4②培养的母种接入所述的装有栽培种培养基并经灭菌冷却至室温的聚丙烯袋中，25°C下培养20d，菌丝长满菌袋后，转入室温下继培养10d，每聚丙烯袋中母种接入量为10g，栽培种培养基四周长满金黄色菌核时，即得到羊肚菌优质菌种。
[0025]实施例2种植应用试验
实验地点:云南省丽江市玉龙县石头乡永红村委会相邻的3亩试验田。
[0026]将实施例1生产的尖顶羊肚菌优质菌种M012保藏于云南省农业科学学院高山经济植物研究所。对该进行连续三年的产量评估。在用该菌株种植前，先将菌株转入室温下继培养10-15d，菌核大量产生后作为栽培种按传统农田栽培模式进行种植。即于2010年、2011年和2012年6月分别对M012菌株进行活化，接入母种培养基中培养，得到母种，再将母种接入栽培种培养基中得到栽培种，2010年、2011年和2012年8月采用传统农田栽培模式进行种植，应用结果:
2011年2月26日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到8~12cm，M012鲜品亩产可达到83.52kg。
[0027]2012年2月29日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到6~13cm, M012鲜品亩产可达到79.95kg。
[0028]2013年2月28日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到5~10cm, M012鲜品亩产可达到81.74kg。
[0029]从以上试验结果中可以看出，M012的连续三年的鲜菇产量平稳、出菇时间稳定、个体生长速度相接近，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。
[0030]所述的传统农田栽培模式是指在农田中，利用圆叶杨为菌材种植羊肚菌的方法。主要栽培措施如下:(I)农田犁耕及圆叶杨菌材准备；栽培前7~10 d，选取直径15~20cm新鲜圆叶杨去枝叶，锯成Im长树段及1.5 m长树段若干，阴凉处放置，种植前I~2 d将每段菌材纵劈4-6份备用。(2)利用石灰、麦麸、木屑、白糖为原材料对栽培种进行发菌；
(3)挖沟一放入菌材一撒上菌种及少量石灰和木屑一盖土，根据不同的菌材累加方法栽培堆呈现不同的形状，如第一层3根菌材，第二层2根菌材，第三层I根菌材，堆成一个锥状，这样可以提高土地利用率。(4)人工管理，覆盖透光率为25%的遮阳网，安装喷灌设施，控制土壤含水量为55_65%。
[0031] 所述的PDA培养基(即马铃薯培养基)配方是:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，1000ml 水。
【权利要求】
1.一种羊肚菌优质菌种的生产工艺，包括以下步骤: (1)羊肚菌的采集时间 于种植羊肚菌第二年的2月~3月，第一茬或第二茬羊肚菌出菇后的第7~10天，10cm <羊肚菌个体长度< 15cm,菌盖饱满,菌盖上棱和凹坑完全展开，菌柄为乳白色时采集无病虫害的羊肚菌菌株； (2)优质菌株的筛选，按如下四级进行逐级淘汰筛选: ①菌盖形态及颜色筛选 菌盖长度>4 cm,2 cm <菌盖最宽处的宽度< 5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级，其余为二级，淘汰第二级； ②菌柄颜色及形态筛选 将步骤(2)①未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度> 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级； ③孢子颜色及数量筛选 A.孢子的收集，将 洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(2)②未淘汰的羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的顶部朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到羊肚菌孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级； B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数< IO2个的为二级，淘汰第二级； ④菌核生成能力筛选 无菌条件下，挑取步骤(2)③B未淘汰的羊肚菌的菌株孢子放入IOml无菌水中，摇匀得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，25°C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取1.0cmX 1.0cm菌块接入PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量，菌丝生长速度>6.4mm/d、菌核数量>40个、菌核生成时间<7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为羊肚菌优质菌株； (3)菌丝的培养 将PDA培养基高压灭菌后，冷却到50-60°C，在无菌条件下，取15ml PDA培养基倒入平板中冷却凝固后，备用；用接种针挑取步骤(2)④获得的羊肚菌优质菌株对应的孢子放入IOml无菌水中，摇匀，得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，25°C暗培养，待长满平皿后备用； (4)母种的制作及培养 ①母种培养基的配制:将浸泡48小时的小麦煮熟后捞出，在煮熟的小麦中加入鹿糖和麦麸，鹿糖的加入量为煮熟的小麦质量的0.1%,麦麸的加入量为煮熟的小麦质量的0.2%,拌匀并控制含水量为30%即得母种培养基； ②母种的制作及培养，将配制的母种培养基装入300ml的聚丙烯培养瓶中，装入的母种培养基量为聚丙烯培养瓶体积的2/3，再将聚丙烯培养瓶在126°C，压力0.15Mpa的条件下灭菌Ih后冷至室温；在无菌条件下，每聚丙烯培养瓶接入IcmX Icm的步骤(3)培养的菌丝后，置于25°C培养箱中，在100 Ix光照下培养，待菌丝长满聚丙烯培养瓶后，转入15°C培养箱中暗培养10~15d ； (5)栽培种的制作及培养 ①栽培种培养基的配制:以质量分数计，用木屑为78%，麦麸为20%，蔗糖为1%，石灰为.0.1%，磷酸二氢钾为0.1%，浸泡48小时的小麦为0.8%混合拌匀并控制含水量为30%即得栽培种培养基； ②栽培种的制作及培养:取栽培种培养基Ikg装入规格为17cmX33cm的聚丙烯袋中，边装边压实，使栽培种培养基体积为聚丙烯袋体积的2/3，用玻璃丝扎口并留缝隙，再将聚丙烯袋在121~126°C，压力0.12~0.15Mpa的条件下灭菌1.5h后，冷却至室温，备用；将步骤(4)②培养的母种接入所述的装有栽培种培养基并经灭菌冷却至室温的聚丙烯袋中，25°C下培养20-30d，菌丝长满菌袋后，转入室温下继培养10-15d，每聚丙烯袋中母种接入量为10g，栽培种培养基四周长满金黄色菌核时，即得到羊肚菌优质菌种。
【文档编号】A01G1/04GK103907481SQ201410157198
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月20日 优先权日:2014年4月20日
【发明者】戚淑威, 徐中志, 赵琪, 陈翠, 侯志江, 程远辉, 和琼姬, 杨少华 申请人:丽江中源绿色食品有限公司, 云南省农业科学院高山经济植物研究所