一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤：将粒度为2-4mm的石英砂于121℃高温下灭菌30分钟，冷却后将其播入无菌12孔细胞培养板中，每孔10g石英砂，每孔加入4ml无菌水；将待测烤烟种子播种于12孔细胞培养板的石英砂上，播种后将12孔细胞培养板置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养；待烟种发芽后，无菌条件下向培养烟苗的12孔微孔板内添加霍格兰营养液，每孔2ml，继续置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养，待烟苗5-6叶期时用于抗病性鉴定；接种液制备及接种；病情调查与分级。本发明能高通量、高效率鉴定烟草青枯病抗性，且一次可以鉴定的烤烟品种多。
【专利说明】一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物抗病性鉴定【技术领域】，具体涉及一种烟草青枯病抗性的鉴定方 法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 由爺科雷尔氏菌 so/aflacear腫（Smith) Yabuuchi et al)引起的烟 草青枯病是一种世界性土传细菌性病害，极具破坏性，并成为制约烟草生产的主要病害。烟 草青枯病在主要产烟省区均普遍发生。该病害是典型的维管束病害，烟草根、茎、叶各部位 均可被侵染，但主要危害植物的根和茎，其主要症状之一是叶片单边萎蔫和过早变黄。目 前，培育和应用抗病品种是防治青枯病最有效的途径。但在抗病育种相关研究中，需要快 速、准确地评价大量材料的抗性表现。常用的鉴定方法有：1)漂浮/盆栽烟苗人工接种鉴定 法。该方法培养温度不稳定，容易受环境温度变化的影响；病原菌浓度易受育苗池中水的体 积及烟盆浇水等因素的影响；近而影响烟苗的发病率和病情指数，影响烟苗抗性水平的鉴 定，鉴定结果不稳定，重复性不高。该方法所需空间大，需要搭建温室大棚、育苗池，需要购 买加热装置，管理成本高，需要人力成本高。该方法通量小，一次可以鉴定的品种较少。此 夕卜，该方法在鉴定期容易受其它病害的影响，如：烟草黑胫病、猝倒病、灰霉病、病毒病、白粉 病等，这些病害会影响烟苗的抗性鉴定结果。2)大田病圃人工接种方法。该方法可以较好 地反应品种的抗性；但该方法鉴定周期长、每年只能鉴定一次、所需病圃面积大、用于鉴定 的烟草材料有限、青枯菌菌悬液需求量大、发病不均匀，且存在供试材料的抗性表现在年份 间和地点间存在差异等问题。盆栽、漂浮烟苗和大田抗性鉴定环境温度难以控制。盆栽和 大田抗性鉴定中病原菌数量难以控制。为了更好地筛选青枯病抗源、培育抗病品种、挖掘抗 病基因，及研究病原宿主互作机制等，亟需建立一套简便、快速和高效的烟草青枯病抗性鉴 定方法。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述缺点而提供一种能高通量、高效率鉴定烟草青枯病抗 性，且一次可以鉴定的烤烟品种多的高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法。
[0006] 本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的： 本发明公开了的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤： (1)培育无菌烟苗 将粒度为2-4_的石英砂于121°C高温下灭菌30分钟，冷却后将其播入无菌12孔细胞 培养板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml无菌水；将待测烤烟种子播种于12孔细胞培养板 的石英砂上，播种后将12孔细胞培养板置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下 培养； (2) 烟苗的日常管理 待烟种发芽后，无菌条件下向培养烟苗的12孔微孔板内添加霍格兰（Hoglangd)营养 液，每孔2ml，继续置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养，待烟苗5-6叶期 时用于抗病性鉴定； (3) 接种液制备及接种 将烟草青枯菌so菌株使用前在劳尔氏菌选择性培养基 (SMSA)上活化48h，挑典型单菌落至劳尔氏菌选择性培养基（SMSA)平板上，30°C培养48h。 将菌苔刮下，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB)培养液，30°C震荡培养36至48h ;培养液 于4000 X g离心20min收集菌体，用无菌水配成菌悬液，调整菌的浓度为1 X 108cfu/mL，按 照0. 5 ml/孔将菌悬液添加至12孔细胞培养板的微孔中； (4) 病情调查与分级 接菌后20d调查发病情况，以后每隔3d调查一次发病情况；记录发病率及病情指数，以 感病对照发病率达到80%左右的病情指数作为品种抗性评价标准。
[0007] 上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨固体培养基 (NA) :牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，琼脂 16g，水 1000ml，pH 6. 8 ?L 2。
[0008] 上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨液体培养基 (NB) :牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，水 1000ml，pH 6. 8 ?7. 2。
[0009] 上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：SMSA培养基：蛋白胨10g， 甘油5mL，水解酪蛋白氨基酸lg，调pH至7. 0,加水配至1L，加琼脂粉16g ;使用时待溶化好 的培养基冷却至50°C左右时每250ml培养基加入1%多粘菌素 B 2. 5ml、1%结晶紫125 μ L、 1%TTC 1. 25ml、l% 杆菌肽 625μ L、0. 1% 青霉素 125μ L、l% 氯霉素 125μ L。
[0010] 本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知：1)本 发明在12孔微孔板中培育烟苗，所需仪器为恒温光照培养箱，占地小、需要空间小；因而经 济、方便，可实现高通量鉴定，一次可以鉴定的烤烟品种多。2)烟草生长和青枯病发病温度 可以恒温控制，发病率和病情指数结果稳定，能真实反应烤烟品种的抗性水平。3)能够准确 控制每品种接菌量，使得发病条件完全一致。4)在整个鉴定过程中，孔内青枯菌浓度和培养 温度稳定，不受培养液体积的变化而变化，近而发病率和病情指数稳定，保证了重复间发病 的均匀性。5)病原菌从根部侵入，接近病害田间自然侵染过程，保证了抗性鉴定结果的可 靠性。6)微孔板石英砂培育烟苗，具备无菌培养环境，避免其它微生物对烟苗生长的影响。 7)有利于年度间和不同实验室间结果重现和比较。该方法在抗病资源和育种材料的抗性鉴 定、抗性遗传规律分析、抗病基因挖掘及分子病理学研究中应用潜力较大。
[0011] 【具体实施方式】 [0012] 实施例1-8 一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤： (1)培育无菌烟苗 将粒度为2-4_的石英砂于121°C高温下灭菌30分钟，冷却后将其播入无菌12孔细胞 培养板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml无菌水。将待测烤烟种子（8个品种均由贵州省
【权利要求】
1. 一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤： (1) 培育无菌烟苗 将粒度为2-4_的石英砂于121°C高温下灭菌30分钟，冷却后将其播入无菌12孔细胞 培养板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml无菌水；将待测烤烟种子播种于12孔细胞培养板 的石英砂上，播种后将12孔细胞培养板置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下 培养； (2) 烟苗的日常管理 待烟种发芽后，无菌条件下向培养烟苗的12孔微孔板内添加霍格兰营养液，每孔2ml， 继续置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养，待烟苗5-6叶期时用于抗病性 鉴定； (3) 接种液制备及接种 将烟草青枯菌菌株使用前在劳尔氏菌选择性培养基上活化48h，挑典型单菌落至劳尔 氏菌选择性培养基平板上，30°C培养48h，将菌苔刮下，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基培 养液，30°C震荡培养36至48h ;培养液于4000Xg离心20min收集菌体，用无菌水配成菌悬 液，调整菌的浓度为1X 108cfu/mL，按照0. 5 ml/孔将菌悬液添加至12孔细胞培养板的微 孔中； (4) 病情调查与分级 接菌后20d调查发病情况，以后每隔3d调查一次发病情况；记录发病率及病情指数，以 感病对照发病率达到80%左右的病情指数作为品种抗性评价标准。
2. 如权利要求1所述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨 固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂16g，水1000ml，pH 6. 8?7. 2。
3. 如权利要求1或2所述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋 白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6. 8?7. 2。
【文档编号】A01G7/00GK104082055SQ201410269005
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】汪汉成, 任学良, 王轶, 蔡刘体, 王茂胜, 陆宁, 王仁刚 申请人:贵州省烟草科学研究院