一种受病原诱导的水稻启动子p71z2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2及其应用，属于水稻生物育种领域。本发明的目的是提供一种从水稻中分离到的能够响应白叶枯病菌侵害，可以作为病原诱导型启动子使用的DNA序列片段，该DNA序列片段是水稻P450单加氧化酶基因Oscyp71Z2（NCBI登录号：Os07g0217600）的转录调控区，其特征是它具有第1位到第1098位的启动子区核苷酸序列。本发明可以作为病原诱导型启动子使用，或用于其它转基因植物的相关调控序列，培育抗病植物中的应用。
【专利说明】一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2及其应用，属于植物基因工程【技术领域】。具体涉及到一个水稻病原诱导型启动子P71Z2的克隆、功能验证和应用分析。
【背景技术】
[0002]水稻在生长发育过程中，经常会受到各种病原(包括稻瘟病菌、白叶枯病菌、细菌条斑病菌以及水稻矮缩病毒等)的侵害。在与病原长期相互作用的过程中，水稻已经进化成多种复杂而有效的抗病机制来抵抗病原的侵染。抗病基因的克隆和应用为水稻病害的防治提供了一个经济有效和环境友好的方法。
[0003]目前，通过转基因技术把抗病基因转入到感病且农艺性状优良的水稻栽培品种是利用抗性资源改良水稻病害抗性的重要途径。尽管大批的抗病基因被克隆以及应用，但是由于应用于转基因载体的启动子多数属于组成型启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费，而且严重地还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡，使得转基因水稻一生中需要消耗掉大量的能量。这是利用转基因技术防治水稻病害的最明显的一个缺陷。为了解决这个问题，申请者试图利用受病原菌诱导启动子调控目的基因表达。
[0004]启动子是位于结构基因上游能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体，且对基因的表达起调控作用的一段DNA序列。一个典型的启动子包括CAAT-box和ΤΑΤΑ-box等核心作用元件。TATA框，又称Hogness框，其一致序列为:TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于_35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。CAAT框，其一致序列为GGC (T) CAATCT。一般位于_75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-1OObp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有其他不同的顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时间，空间或表达量进行特异性的调控。按照功能及作用方式可大致分为组成型表达启动子、组织特异性表达启动子和诱导型表达启动子三大类。正如前文所述，组成型表达启动子在转基因作物中驱使目的基因持续大量表达，浪费作物能量并带来损失，而组织特异性启动子使目的基因在某一组织中特定地表达，可以较好地解决这一方面的问题。目前，诱导型启动子是公认的有较好应用前景的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个来自于水稻受到病原菌诱导表达的启动子P71Z2。
[0007]本发明的另一目的是提供病原菌诱导型启动子的克隆和功能鉴定的方法。
[0008]本发明的又一目的是提供病原菌诱导型启动子的应用。
[0009]本发明的目的是从水稻中克隆抗病相关基因0scyp71Z2的启动子P71Z2DNA序列，并利用转基因进行功能验证，同时分析该基因在水稻中的组织表达模式，为利用抗性基因改良水稻病害抗性提供了资源。
[0010]技术方案
[0011]本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2，其特征在于:该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中0scyp71Z2基因转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1098bp 的 DNA，序列如 SEQ.1D.N0.1。
[0012]所述水稻启动子P71Z2通过调控目标基因表达可以在水稻细菌病害抗性中得到应用。
[0013]采用PCR(Polymerase chain react1n)技术可以从基因组中扩增得到本发明的启动子P71Z2以及任何一段DNA或与其同源的一段DNA。将克隆到的DNA片段构建携带有报告基因gus的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化法，获得转基因水稻。利用实验室人工接种方法对转基因水稻进行白叶枯病接菌，通过组织化学染色法和GUS活性检测从而鉴定启动子P71Z2响应病原的能力。
[0014]有益效果
[0015]本研究所提供的水稻病原诱导启动子P71Z2的克隆及其应用，具有如下优点:
[0016]通过本发明获得了水稻病原诱导型启动子P71Z2。
[0017]将克隆的启动子P71Z2连接到双元载体调控抗性基因表达，利用转基因技术转入水稻，可以使转基因水稻在受病原菌侵染后诱导目标基因表达，从而避免植物因过量表达目标基因对自身造成的损伤。这也弥补了传统组成型启动子因始终强启动目的基因表达造成生长发育受阻等一系列致命缺陷。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1P71Z2启动子克隆。1，启动子P71Z2PCR扩增；3，启动子P71Z2表达载体pBI121/Pro 双酶切验证；2 和 5，DNAmarkerDL2000 ;4，DNAMarker λ -Hindlll。
[0019]图2遗传转化载体图谱。LB和RB分别是T-DNA左右边界；N0S，胭脂碱合成酶编码基因终止子；N0SP，胭脂碱合成酶编码基因启动子；NPTII，是卡那霉素抗性基因(标记基因)；Pro,启动子Ρ71Ζ2 ;gus,是β-glucuronidase gene ( β -葡萄糖醒酸酶,报告基因)。
[0020]图3P71Z2启动子受白叶枯病菌诱导。R是抗白叶枯病转hrfI基因水稻株系NJHl2 ；S是感病野生型水稻R109。
[0021]图40scyp71Z2基因表达模式。(A)叶片；(C)茎节；(D)颖壳；(G)主根；(F)外稃；(B)和(E)为叶片和茎节的横切面。
[0022]图5转P71Z2启动子水稻的⑶S活性受白叶枯病菌诱导。
【具体实施方式】
[0023]下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0024](一 )实验方法
[0025]1.1载体构建
[0026]根据启动子在线分析软件PROSCAN (http: //bimas.dcrt.nih.gov/molb1/proscan)预测的0scyp71Z2基因启动子P71Z2序列如SEQ.1D.N0.1，利用引物设计软件 01igo6 设计启动子 P71Z2 上游引物 Up:cccaagcttGTACAAGGGCTGACAGATGGG,上游引物加 HindIII 酶切位点；下游引物 Down:cgcggatccGCCCGTAGGATCGATGTGCTGTA，下游引物加BamHI酶切位点。用HS高保真酶从模式粳稻品种日本晴基因组中扩增0scyp71Z2编码区5，端1098bp序列片段。扩增条件:95°C预变性4min ;95°C变性40s、58°C复性45s,72°C延伸45s，32个循环；最后72°C延伸lOmin。凝胶电泳显示在1098bp处有特征条带(图1)。用PCR产物试剂盒纯化DNA后，用HindIII和BamHI分别双酶切纯化的启动子PCR产物 DNA、pBI121 双兀表达载体(Shao M, WangJ, Dean RA, Lin Y, GaoX, Hu S.Express1nof a harpin-encoding gene in rice confers durable nonspecific resistance toMagnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81),凝胶电泳、分别切胶回收启动子DNA、pBI121大片段DNA，T4连接酶过夜连接构建pBI121::P71Z2质粒，转化大肠杆菌DH5a (Shao Μ, WangJ, Dean RA, Lin Y, Gao X, HuS.Express1n of a harpin-encodinggene in rice confers durable nonspecific resistance to Magnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81)，挑取单克隆，接种含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C过夜培养后，提取质粒分别用HindIII和BamHI双酶切验证，凝胶电泳结果显示在1098bp处具有特征条带(图1)。随后送2ml菌液到上海英俊生物技术有限公司测序，结果显示没有碱基错配，此时已成功构建由启动子P71Z2驱动gus基因表达的双元表达载体pBI121/Pro(图 2)。
[0027]1.2质粒转化
[0028]1.2.1质粒转化大肠杆菌(I)受体菌DH5 α在LB平板上划线，37°C活化培养；挑取一个单菌落接种到20ml的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；
[0029](2)按I %的接种量，吸取0.5ml将过夜培养的母液接种到50mlLB液体培养基，于37°C剧烈振荡培养2-3h ；
[0030](3)在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌50ml离心管中，在冰上放置lOmin，使培养物冷却至0°C ;(后面的5-9步骤必须在冰浴条件下完成。)
[0031](4)离心收集菌体细胞(4，000r/min,4°C, 1min)。倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留的痕量培养液流尽。
[0032](5)用5ml冰预冷的0.lmol/LCaCl2重新悬浮菌体沉淀,放置于冰上lOmin。
[0033](6)离心收集菌体(4，000r/min,4°C, 1min)。到出CaCl2，将管倒置Imin以使残留的CaCl2流尽。
[0034] (7)用Iml冰预冷的0.lmol/LCaCl2重悬菌体。此时,将悬浮液用eppendorf管分装成小份，每管200μ I ;
[0035](8)用无菌吸头在每管中加DNA(体积≤10 μ I, DNA ≤ 50ng)，轻轻旋转或轻弹管壁以混匀内容物，在冰中放置30min ；
[0036](9)将管放到42°C水浴中热激90s，不要摇动试管；
[0037](10)快速将试管转移到冰浴中，使细胞冷却l_2min ；
[0038](11)每管中加入800 μ ILB液体培养基后，放到37°C摇床振荡培养45min ；
[0039](12)吸取适当体积已转化的感受态细胞加到含Km(20 μ g/ml)的LB固体平板上，用L玻棒轻轻地把细胞均匀地涂到琼脂平板表面；
[0040](13)将平板置于室温至液体被吸收；
[0041](14)倒置培养皿于37°C培养12_16h，待单菌落长出后提取质粒酶切验证。
[0042]1.2.2 质粒转化农杆菌(I)受体菌 EHAlO5 (Shao M, Wang J, Dean RA, Lin Y, GaoX, HuS.Express1n of a harpin-encoding gene in rice confers durable nonspecificresistance to Magnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81)在 YEB 平板上划线，28 °C活化培养；
[0043](2)挑取一个单菌落接种到2ml的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜；
[0044](3)在200ml的YEB培养基中稀释，28 °C振荡培养3_4h。
[0045](4)在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌50ml离心管中，3000rpm4°C离心10min，
去上清O
[0046](5)用 1ml 预冷的 ΤΕ(ρΗ7.5)洗涤。
[0047](6) 3000rpm4°C离心 1min,去上清。
[0048](7)用 20mlYEB 重悬。
[0049](8)按每管500 μ I分装，液氮中冷冻，即为感受态细胞。
[0050](9)将感受态细胞置于冰浴中，加入0.5-1.0yg重组质粒DNA，冰上放置5min。
[0051](10)置液氮中 5min。37°C保温 5min。
[0052](11)用 ImlYEB 稀释，在 28 °C 震摇 2_4h。
[0053](12)取200 μ I涂布于含有卡那霉素50mg/L+利福平50mg/L的YEB平板上，28°C培养过夜，待单菌落长出后提取质粒验证。
[0054]1.3水稻成熟胚愈伤组织的诱导和继代
[0055](I)将表面灭菌的含胚米粒接种到N6D2培养基上，28°C生化培箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生；
[0056](2)将新长出的愈伤组织从种子上剥下，转入新的N6D2培养基上，继代培养。每两周继代一次，共继代2次，取新鲜嫩黄的愈伤组织用于农杆菌侵染。
[0057]1.4愈伤组织与农杆菌的共培养
[0058](I)将愈伤组织浸入重悬的农杆菌菌液中，摇匀后静置30min ；
[0059](2)移出愈伤 ，用灭菌滤纸吸净残液，平铺到盛有无菌滤纸的N6D2固体培养基表面，用2-3mlN6D2-AS培养液润湿愈伤，23°C生化培养箱暗培养3d。
[0060]1.5获得转？7122启动子水稻
[0061](I)挑选l_2mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织，转至MS1-CG培养基上在智能光照培养箱26°C，光强300001ux，预分化2周。
[0062](2)转至分化培养基MS2-CG上培养，在智能光照培养箱26°C，光强300001ux，分化。每2周继代一次，直至得到抗性植株。
[0063](3)部分矮小丛生小苗转至MStlG培养基上使其伸长。
[0064](4)分化好的幼苗转至生根培养基1/2MSNG上。筛选、生根直至长成完整植株。
[0065](5)将生长完整的水稻植株移入灭菌土中，在智能光照培养箱26 °C，光强300001ux，光照14h，黑暗1h培养或移入温室中培养生长。
[0066]1.6病原菌接种
[0067]将抗白叶枯病转hrf I基因水稻株系NJH12和感病野生型水稻R109(材料均为公知公用，见 Li ffenqi, Shao Min, Zhong ffeigong, Yang Jie, Kazunori Okada, HisakazuYamane, Zhang Lei, Wang Guang, Wang Dong,Xiao Shanshan, Chang Shanshan,QianGuoliang, Liu Fengquan.Ectopic express1n of hrfI enhances bacterial resistancevia regulat1n of diterpene phytoalexins, silicon and reactive oxygen speciesburst in rice.PLoS ONE, 2012, 7(9):e43914.)以及转 P71Z2 启动子水稻盆栽于江苏省南京市江苏省农科院粮食作物研究所网室，用白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xoo)强致病菌株 PX099A(公知公用，见 Li ffenqi, Shao Min, Zhong ffeigong, YangJie,Kazunori Okada, Hisakazu Yamane, Zhang Lei, Wang Guang, Wang Dong, XiaoShanshan, Chang Shanshan, Qian Guoliang, Liu Fengquan.Ectopic express1n of hrfIenhances bacterial resistance via regulat1n of diterpene phytoalexins, siliconand reactive oxygen species burst in rice.PLoS ONE, 2012, 7 (9):e43914.)分别在分蘖期和孕穗期接种，具体操作方法参考《植病研究方法》。
[0068]1.7⑶S组织化学染色
[0069](I)取2支1.5ml离心管，各加入0.5mllmol/LGUS染色液；
[0070](2)采取适量大小的转基因和野生型水稻组织，分别放入上述离心管中；
[0071](3)37°〇浸泡过夜(或2-511);
[0072](4)倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；换一次75%乙醇脱色；
[0073](5)观察染色情况，拍照。如果有⑶S表达产物，则出现蓝色出现蓝色。
[0074]⑶S染色液配置:在450mlddH20中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚铁氰化钾，50ml lmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，加水至500ml，4°C储存备用。
[0075]ImoI/LGUS染色液:用DMSO溶解lOOmgX-Gluc，再加入⑶S工作液，定容100ml，分装成小管，置于_20°C储存备用。
[0076]( 二)结果显示
[0077]利用启动子分析软件预测启动子P71Z2序列，并利用PCR技术从粳稻模式种日本晴中克隆该启动子(图1)。成功构建了用于病原菌诱导型启动子P71Z2的双元表达载体(图2)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得转P71Z2启动子水稻。用白叶枯病菌强致病菌株PX099a接种抗白叶枯病转hrf I基因水稻株系NJH12和感病野生型水稻R109后，该启动子P71Z2受白叶枯病菌诱导(图3)。在转P71Z2启动子水稻中，主要在根、节和叶片中检测到GUS活性(图4)。转P71Z2启动子水稻受到白叶枯病菌PX099a侵染后，GUS蛋白活性显著升高，约是未接菌的2-4倍(图5)。这些结果表明，该启动子P71Z2能够响应白叶枯病菌的侵染。
[0078]附录
[0079]1、LB培养基(培养大肠杆菌)
[0080]LB液体培养基成份:称取胰蛋白胨1g ;氯化钠1g ;酵母粉5g ;加水500ml ;加热溶解后定容至1000ml，调pH值至7.0-7.2，每瓶50ml分装后高压灭菌。LB固体培养基(LA)为每100ml液体培养基中加入15g琼脂,加相应抗生素(氨节霉素和潮霉素)后倒入平板备用。
[0081 ] 2、YEB培养基(培养农杆菌)
[0082]液体培养基成份:称取牛肉浸膏5g ;鹿糖5g ;聚蛋白胨5g ;硫酸镁2mmol/L ;酵母粉Ig ;加入500ml水，加热溶解后定容至1000ml，调pH值至7.2，分装后高压灭菌。配制YEB固体培养基时每100ml液体培养基中加入15g琼脂，加相应抗生素后倒入平板。
[0083]3、转基因用到的培养基配方
[0084]所涉及到的培养基:
[0085]
【权利要求】
1.一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2，其特征在于:该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中基因转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1098 bp的DNA，序列如 SEQ.1D.N0.1。
2.权利要求1所述一种受病原诱导的水稻启动子P71Z2的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，水稻启动子P71Z2通过调控目标基因表达在水稻细菌病害抗性 中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104131011SQ201410385644
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】李文奇, 杨杰, 王军, 范方军, 朱金燕, 仲维功 申请人:江苏省农业科学院