一种野外分离中华散尾鬼笔子实体的方法与流程

本发明涉及一种野外分离中华散尾鬼笔子实体的方法，尤其涉及一种利用自制便携式超净工作台组织分离中华散尾鬼笔子实体的方法。

技术背景

中华散尾鬼笔(Lysurus mokusin)属于笼头菌科(Clathraceae)，散尾鬼笔属(Phallus)。中华散尾鬼笔菌头部细长，呈棱柱形，头部有4-5个爪状裂片，红色，初期裂片相互连接一起，后期从顶部彼此分离，靠内侧面产生暗褐色孢体粘液，具臭味。菌柄浅粉至浅肉色，具4-5条纵行凹槽，松软呈海绵状。菌托白色。进来有关于误食中华散尾鬼笔中毒的报道。因此，有学者推断其是否可以在森防中作生物农药。为了进行深入研究，需要对中华散尾鬼笔进行人工培养，但是，目前没有针对其进行分离的方法。

普遍使用的分离大型真菌子实体的方法为组织分离法。常规的组织分离方法是:野外采集的大型真菌子实体作为分离材料，在超净工作台中，用无菌水冲洗后，用75％的酒精溶液表面消毒。取消毒过的刀片纵切，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织(火柴头大小)，接种到PDA培养基上3-5天后，接种块上产生白色绒毛状菌丝，即为组织分离得到的菌种。但是，在野外，因为条件的限制，从采集地将新鲜子实体运回实验室内，在采集后的8小时内在超净工作台中进行分离，会受路途、天气、虫蚀、腐烂等因素影响子实体的新鲜度，给分离造成困难。因此建议野外采集，就地分离。

中华散尾鬼笔没有菌盖，子实体内部为网状中空结构，子实体柔软，不耐运输和保存。所以不能使用上述方法分离。即使需要就地分离，也会因为其特殊的结构和性质，需要精细的操作和消耗较长的时间而容易被分布广泛的杂菌污染，导致分离成功率低。克服野外分离中华散尾鬼笔子实体时的上述困难，需要发明特殊的器材和分离方法。

技术实现要素：

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了自制便携式超净工作台组织分离中华散尾鬼笔子实体的方法，并且分离时取头部和菌柄交界处的内层网状组织的方法。采用本发明能够提高中华散尾鬼笔子实体野外分离的成功率。

本发明的技术方案是：利用自制便携式超净工作台就地采集，就地分离，分离时取头部和菌柄交界处的内层网状组织。

包括以下步骤:

1.培养基的配制，配制PDA斜面培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min备用。

2.将自制便携式超净工作台用75％的酒精溶液擦拭消毒。

3.将手术刀、镊子、火柴、记号笔、PDA培养基分别用75％的酒精溶液擦拭消毒后快放入自制便携式超净工作台，夹在C型管卡上，卡住卡扣密封。

4.夏末秋初携带自制便携式超净工作台进入林场，在落叶松林下地被物上采集中华散尾鬼笔进行分离。

5.将采集到的中华散尾鬼笔子实体用浸有0.1％的升汞的棉球擦拭消毒，然后用锡纸包住，放入自制便携式超净工作台，卡住卡扣密封，打开紫外灯灭菌20min。关闭紫外灯，打开节能照明灯。双手从手套中伸入自制便携式超净工作台，点燃酒精盒，将手术刀从C型管卡上取下，在酒精盒火焰中来回几次，后横向切开子实体的头部与菌柄交界处，然后取下镊子在酒精盒火焰中来回几次，后撕取一小块0.5cm左右的内层网状组织，在火焰附近接入PDA培养基，然后将试管管口和棉塞在火焰中来回几次，塞好棉塞，用记号笔在试管外壁标记。

6.把用过的手术刀和镊子在酒精盒火焰中来回几次，同记号笔和火柴一起，夹回C型管卡上。

7.分离完成后，熄灭酒精盒，打开自制便携式超净工作台，把接种好的PDA培养基和残留的中华散尾鬼笔子实体取出，用75％的酒精溶液擦拭自制便携式超净工作台，卡住卡扣密封，以备下一次分离操作 使用。

8.接种好的培养基在25℃下避光培养15d至长满培养皿。

本发明与已有发明相比，具有以下优点：

1.分离时取头部与菌柄交界处的内层网状组织，成功率更高，分离出的菌种菌丝体生长更快，菌丝体更致密蓬松。

2.自制便携式超净工作台体积小，轻便，可移动，采集中华散尾鬼笔子实体过程中可全程携带。

3.自制便携式超净工作台前壁，侧壁和上壁的前半部分的材质为有机玻璃(2)，操作时，视野开阔，且有机玻璃质量轻，减轻了自制便携式超净工作台的重量。

4.自制便携式超净工作台的前壁可以打开，方便放入材料和工具，也方便取出残留材料和接种好的PDA培养基。

5.自制便携式超净工作台带有卡扣(6)和硅胶密封条(3)，可以密封。

6.双手可以从手套(4)中伸入，防止污染。

7.手套采用硅胶材质，耐高温，并且能提高操作灵敏度。

8.自制便携式超净工作台的内壁有C型管卡(9)，可以固定放入自制便携式超净工作台的工具和培养基，携带过程中不会互相磕碰损坏工具和培养基。

9.自制便携式超净工作台带有酒精盒(12)，使分离操作可以在火焰附近进行，并且可以在火焰中对工具进行灭菌，避免了交叉污染。

10.自制便携式超净工作台中的酒精盒(12)中装的是固体酒精，没有流动性，方便携带。

11.自制便携式超净工作台带有锂聚合物电池(10)，电量可供一天野外操作。

12.自制便携式超净工作台带紫外灯(8)，可以在进行分离操作前对便携式超净工作台内部环境进行灭菌。

13.自制便携式超净工作台带有节能照明灯(7)，即使在昏暗条件下也可以进行组织分离操作。

14.本发明可避免分离过程中杂菌的污染，提高野外组织分离的成功率。

15.本发明也可用于野外分离其他大型真菌子实体。

附图说明

图1为便携式超净工作台的剖面示意图

(1)铰链 (2)有机玻璃 (3)硅胶密封条 (4)手套 (5)把手 (6)卡扣 (7)LED照明灯 (8)紫外灯 (9)C型管卡 (10)锂聚合物电池 (11)酒精盒盖 (12)酒精盒 (13)铝合金板材

图2为便携式超净工作台的透视示意图

具体实施方式

具体实施方式一：如图1所示，野外采集子实体前，将自制便携式超净工作台用75％的酒精擦拭消毒，然后将手术刀、火柴、镊子、记号笔分别用75％的酒精溶液擦拭消毒，放入便携式超净工作台，夹在C型管卡(9)上，卡住卡扣(6)密封。采集到中华散尾鬼笔后，在自制便携式超净工作台外用浸有0.1％的升汞的棉球分别擦拭子实体消毒，然后用锡纸包住，放入自制便携式超净工作台，卡住卡扣(6)密封，打开紫外灯(8)灭菌20min。关闭紫外灯(8)，打开节能照明灯(7)。双手从手套(4)中伸入自制便携式超净工作台，点燃酒精盒(12)，将手术刀从C型管卡(9)上取下，在酒精盒火焰中来回几次，后横向分为切开头部与菌柄交界处的子实体，然后取下镊子在酒精盒火焰中来回几次，后撕取一小块内层网状组织，在火焰附近接入PDA培养基，然后将试管管口和棉塞在火焰中来回几次，塞好棉塞，用记号笔在试管外壁标记。把用过的手术刀和镊子在酒精盒火焰中来回几次，同记号笔和火柴一起，夹回C型管卡(9)上。依次用上述方法组织分离采集到的中华散尾鬼笔子实体后，熄灭酒精盒(12)，打开自制便携式超净工作台，把接种好的真菌培养基和残留的中华散尾鬼笔子实体取出，用75％的酒精溶液擦拭自制便携式超净工作台，卡住卡扣(6)密封，以备下一次分离操作使用。

具体实施方式二：将采集到的中华散尾鬼笔子实体就地采集，就地分离。采集到的子实体用无菌水冲洗，然后点燃酒精灯，在火焰附近徒手横向撕开子实体的头部与菌柄交界处，将镊子在火焰上来回几次，然后撕取一小块0.5cm左右的内层网状组织，接种到PDA培养基上。与用具体实施方式一中的方法在自制便携式超净工作台分离接种的培养基一起在25℃下避光培养15d。每种方法分离5管，每天观察，记录污染状况，结果见表1。

表1不同分离方法的污染率

在自制便携式超净工作台进行野外分离可以提高分离的成功率。

具体实施方式三：用具体实施方式一中的方法，在分离时分别取头部，头部与菌柄交界处和菌柄基部的一小块内层组织接种到PDA培养基上。待长出白色绒毛状菌丝后，在实验室内分别挑出菌丝接种到PDA培养皿中，做好标记。待培养皿中的菌丝体长出一部分后，接种到新的PDA培养皿中继续培养。在25℃的恒温培养箱中避光培养15天至满皿。每24小时测量并记录菌丝直径和生长状态，结果见表2。

表2取样部位与菌丝体生长速率的关系

取菌柄基部进行分离时和取另两个部位时菌丝生长速率具有显著型差异，且菌丝体稀疏扁塌；取头部和取头部与菌柄交界处进行分离时，菌丝生长速率无明显差异；通过观察菌丝体形态，取头部进行分离的菌丝体稀疏扁塌，而取头部与菌柄交界处进行分离的菌丝体致密蓬松。由此可以得出，分离中华散尾鬼笔时取头部与菌柄交界处的组织会达到更好的分离效果。

具体实施方式四：用具体实施方式一中的方法，待长出白色绒毛状菌丝后，在实验室内分别挑出菌丝接种到PDA培养皿中心，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下避光培养至满皿，每天观察记录菌丝直径，结果见表4。

表4培养温度与菌丝生长速率的关系

在25℃下避光培养时菌丝平均生长速率最大，且菌丝体形态好；在15℃、20℃、30℃下避光培养时菌丝平均生长速率无明显差异；在10℃下避光培养要好于在35℃下闭关培养。所以，在25℃下避光培养更有利于菌丝生长。

具体实施方式五：用具体实施方式一中的方法，待长出白色绒毛状菌丝后，在实验室内分别挑出菌丝接种到PDA培养皿中心，分别避光，全光，半光半暗在25℃下培养至满皿，每天观察记录菌丝直径，结果见表5。

表5光照与菌丝生长速率的关系

全光条件下平均生长速率与另两种光照条件下存在显著差异，且菌丝体稀疏扁塌；避光条件与半光半暗条件下平均生长速率无显著差异；半光半暗条件下菌丝体形态没有避光条件下茂密蓬松。所以，避光培养更有利于菌丝生长。