本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及一种新型三七种苗根系生物包衣剂及其制备方法与应用。
背景技术：
三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物，主产于云南文山，是我国名贵的传统中药，也是云南省重要的特色植物药。上世纪80年代以来，随着三七有效成分和药理作用的不断阐明，三七产品不断开发，市场需求日益增加。近年来，随着三七产业规模的扩大，三七种植业中连作障碍问题非常突出。连作引起三七根部病害大面积爆发，导致三七植株烧须，烂根，致使地上部分死亡，常年损失5％～20％，严重者达70％以上，甚至绝苗，全园绝收，使三七的种植地不得不向外扩张，导致三七道地药材无地可种的尴尬局面，严重阻碍了三七相关产业的发展。
克服三七连作障碍，是确保三七资源可持续发展的关键问题。研究发现三七2～3年的连作生长，造成土壤微生物区系发生变化，有益微生物减少，病原菌数量及丰度增加，导致植物病虫害加重，是造成三七连作障碍的主要原因。要从根本上解决或减轻三七生产中的连作障碍问题，就必须从壮苗移栽及改善土壤微生态环境入手。
迄今，现有技术未见有本发明的一种新型三七种苗根系生物包衣剂的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型三七种苗根系生物包衣剂及其制备方法与应用。移栽前在三七种苗的表面加上一层带有一定量活菌体的生物保护膜，这层膜既能保护三七种苗在运输和移栽过程中不受机械损伤，又能减少须根的水分丧失，更重要的是该膜中的有益微生物能够改变三七种苗周围土壤的微生物群落，改善微生态环境，使之更有利于三七的生长发育，提高三七幼苗的成活率、存苗率及提高三七的产量和质量。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种三七种苗根系生物包衣剂，其是用水溶性成膜材料、植物益生菌、生长素制成的水溶性凝胶，在三七种苗的根部表面形成一层携带有益菌株的生物膜，由下述方法制备而得：称取适量水溶性成膜材料，用热水溶解成5％～10％的水溶液，冷却至28～30℃时，将等体积的水溶性成膜材料与含有一定植物益生菌真菌、放线菌和细菌的水溶液混合，在混合液中加入根系生长促进剂，混合均匀得含有益生菌菌体的三七种苗根系生物包衣剂。
如所述的一种三七种苗根系生物包衣剂，其中所述的成膜材料为聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、羟甲基壳聚糖、阿拉伯胶、明胶、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸衍生物及多元醇聚合物中的一种或多种复配；所述的益生菌为球毛壳菌、角毛壳菌、米修链霉菌、拟无枝酸杆菌的一种或多种组合，益生菌真菌浓度为1.0х105～2.5х105个孢子/mL，放线菌和细菌浓度为1.0х105～2.5х105CFU/mL范围；所述的根系生长促进剂为萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸，将萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸先用少量乙醇溶解后加水稀释，添加到三七种苗根系生物包衣剂中，使根系生长促进剂最终浓度为三七种苗包衣剂的0.01-0.03％。
本发明同时提供了另一种三七种苗根系生物包衣剂，其由下述方法制备而得：精密称取聚乙烯吡咯烷酮90g，加热水1000mL，搅拌使其充分溶解；将球毛壳菌和角毛壳菌用常规固体培养方法在PDA培养基中培养18天，所述PDA培养基配方为：土豆200g去皮，切成1cm3小块，煮沸20‐30min，过滤，滤液加入葡萄糖10g，琼脂20g，用纯净水定容到1L，pH自然；待培养皿上部长满孢子，用结晶刀取出，分别将两种真菌配制成浓度为2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液各500mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 300mg,用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1.5mg/mL的IAA母液；然后，待聚乙烯吡咯烷酮水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的9％聚乙烯吡咯烷酮水溶液1000mL、球毛壳菌2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液400mL、角毛壳菌2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液400mL和浓度为1.5mg/mL的IAA 200mL混合，充分搅拌，使其混合均匀。
以及，另一种三七种苗根系生物包衣剂，其由下述方法制备而得：精密称取羟丙基甲基纤维素70g，加热水1000mL,搅拌使其充分溶解；米修链霉菌和拟无枝酸杆菌用常规固体培养方法分别在海藻糖‐脯氨酸S2固体培养基和LB固体培养基中增殖培养48h，所述海藻糖‐脯氨酸S2固体培养基配方为：海藻糖5g，脯氨酸1g，(NH4)2SO4 1g，NaCl 1g，CaCl2 2g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，复合维生素：核黄素1mg、烟酸1mg、泛酸钙1mg、肌醇1mg、生物素1mg、P‐氨基苯甲酸1mg、VB1 1mg、VB6 1mg，琼脂20g，补水到1000mL，pH 7.2；所述LB固体培养基配方为：酵母粉5g，胰蛋白胨8g，NaCl 4g，琼脂15g，pH 6.8；待菌落布满整个培养皿，用结晶刀取出，分别将米修链霉菌和拟无枝酸杆菌配制成浓度为1.5х105CFU/mL的菌悬液各400mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 300mg,用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1.5mg/mL的IAA母液；然后，待羟丙基甲基纤维素水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的7％羟丙基甲基纤维素水溶液1000mL、米修链霉菌1.5х105CFU/mL的菌悬浮液400mL、拟无枝酸杆菌1.5х105CFU/mL的菌悬浮液400mL和浓度为1.5mg/mL的IAA200mL混合，充分搅拌，使其混合均匀。
及，另一种三七种苗根系生物包衣剂，其由下述方法制备而得：精密称取海藻酸钠80g，加热水1000mL,搅拌使其充分溶解；球毛壳菌、角毛壳菌用常规固体培养方法分别在PDA培养基中增殖培养18天，所述PDA培养基配方为：土豆200g去皮，切成1cm3小块，煮沸20‐30min，过滤，滤液加入葡萄糖10g，琼脂20g，用纯净水定容到1L，pH自然；待培养皿上部长满孢子，用结晶刀取出，分别将两种真菌配制成浓度为2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液各500mL；拟无枝酸杆菌在LB固体培养基中增殖培养48h，所述LB固体培养基配方为：酵母粉5g，胰蛋白胨8g，NaCl 4g，琼脂15g，pH 6.8；待菌落布满整个培养皿，用结晶刀取出，将拟无枝酸杆菌配制成浓度为1.5х105CFU/mL的菌悬液400mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 200mg,用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1mg/mL的IAA母液；然后，待海藻酸钠水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的8％海藻酸钠水溶液1000mL、球毛壳菌2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液300mL、角毛壳菌2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液200mL和拟无枝酸杆菌1.5х105CFU/mL的菌悬浮液300mL及浓度为1mg/mL的IAA200mL混合，充分搅拌，使其混合均匀。
本发明同时提供了一种三七种苗根系生物包衣剂的制备方法，该方法包括如下步骤：取水溶性成膜材料，用热水溶解成5～10％的水溶液，冷却至28～30℃时，将等体积的水溶性成膜材料与含有一定益生菌浓度的水溶液混合，在混合液中加入根系生长促进剂，混合均匀即得含有益生菌菌体的三七种苗根系生物包衣剂。
如所述的一种三七种苗根系生物包衣剂的制备方法，所述方法中成膜材料为聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、羟甲基壳聚糖、阿拉伯胶、明胶、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸衍生物及多元醇聚合物中的一种或多种复配；所述的益生菌为球毛壳菌、角毛壳菌、米修链霉菌、拟无枝酸杆菌的一种或多种组合，所述的益生菌真菌浓度为1.0х105～2.5х105个孢子/mL，放线菌和细菌的浓度为1.0х105～2.5х105CFU/mL范围；所述的根系生长促进剂为萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸，将萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸先用少量乙醇溶解后加水稀释，添加到三七种苗根系生物包衣剂中，其最终浓度为三七种苗包衣剂的0.01-0.03％。
如所述的一种三七种苗根系生物包衣剂的制备方法，该方法分别称取成膜材料聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、羟甲基壳聚糖、阿拉伯胶、明胶、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸衍生物及多元醇聚合物中的一种或多种复配，用热水溶解成5～10％的水溶液，冷却至28～30℃时，将等体积的水溶性成膜材料与含有1.0х105～2.5х105个孢子/mL或1.0х105～2.5х105CFU/mL浓度的活菌体球毛壳菌、角毛壳菌、米修链霉菌、拟无枝酸杆菌的一种或多种组合的悬浮液充分混合均匀，在混合液中加入根系生长促进剂萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，使其在三七种苗根系生物包衣剂中的浓度为0.01‐0.03％，混合均匀得三七种苗根系生物包衣剂。
本发明还提供了所述的一种三七种苗根系生物包衣剂在三七种植中的应用，其特征在于将一年生三七种苗采挖出土，抖去根部泥土，蘸取三七种苗根系生物包衣剂后，于通风、阴凉处摊晾2h，使包衣剂成膜，之后整齐地放入运输框中，次日种植于大田中。
以及，所述的一种三七种苗根系生物包衣剂在三七种植中的应用，其特征在于将一年生三七种苗采挖出土，抖去根部泥土，蘸取三七种苗根系生物包衣剂后，于通风、阴凉处摊晾2h，使包衣剂成膜，之后整齐地放入运输框中，次日种植于大田中，增加三七种苗的出苗率，降低立枯病和根腐病的发病率，增加二年生三七的存苗率，增加三七头子的干重。
本发明的有益微生物包括球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、角毛壳菌(Chaetomiumcupreum)、米修链霉菌(Streptomyces misionensis)、拟无枝酸杆菌(Amycolatopsisvancoresmycina)的一种或多种组合。根系生长促进剂包括萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)等生长素。上述所述生长素的使用浓度及配制方法是指将生长素先用少量乙醇溶解后加水稀释并添加到三七种苗根系生物包衣剂中，使其最终浓度为所配制三七种苗包衣剂的0.01-0.03％。
本发明的制备方法得到的三七种苗根系生物包衣剂不仅能保护三七种苗在运输和移栽过程中不受机械损伤，又能减少须根的水分丧失，更重要的是该膜中的有益微生物能够改变三七种苗周围土壤的微生物群落，改善微生态环境，使之更有利于三七的生长发育，提高三七幼苗的成活率、存苗率及提高三七的产量和质量。
与现有技术相比较，本发明的优异性在于：
本发明中加入的水溶性成膜材料有效的避免及减少三七种苗在运输及移栽过程中造成的表皮破损，减轻三七种苗根系失水，提高移栽成活率。本发明中选用的三七根系生长促进物质萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸具有很好的促生根作用，既能增加须根的数量又可以增强根系活力和适应能力，保证了三七幼苗的健康生长。更重要的是，本发明中添加的益生菌球毛壳菌(C.globosum)、角毛壳菌(C.cupreum)、米修链霉菌(S.misionensis)和拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)在三七种苗移栽后即能萌发生长，并逐步形成三七根际环境中的优势微生物种群，有效抑制三七病原菌的生长和发育，从根本上预防和减轻三七栽培中频发的立枯病和根腐病等病害。
本发明提供了一种新型三七种苗根系生物包衣剂及其制备方法和应用。本发明是用水溶性成膜材料、三七益生菌、生长素制成的水溶性凝胶，在三七种苗的根部表面形成一层携带有益菌株的生物膜。本发明提供的三七种苗根系包衣剂具有良好的成膜性、透气性、并携带适量具有快速增殖能力的有益微生物，不仅能够保证三七种苗的存活还能改善三七后期生长的微生态环境，最终达到三七增产的目的。使用本发明制备方法得到的三七种苗根系保护膜既能减小由于三七种苗运输和移栽过程中造成机械损伤，进而造成的有害微生物的侵染。同时，该带有大量益生菌的生物膜能很好的溶解于三七种苗栽培土壤的自由水中，增加有益菌群的综合优势比，有效改善了三七种苗根际的微生态环境，使三七益生菌成为三七根际微生物的优势菌群，抑制了有害微生物的繁殖和增长。有效降低由三七土传病菌侵染引发的立枯病和根腐病的发病几率和病情指数，提高三七种苗的发芽率、存苗率及增加单株产量。
具体实施方式：
下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不以此为限。
实施例1：
精密称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP)90g，加热水1000mL，搅拌使其充分溶解；对菌种进行活化后(菌种活化系指将低温保存的菌株置于常温条件下复苏，之后接种在固体培养基中，于25～28℃条件下进行继代培养2-3次，获得生长良好的菌落)的球毛壳菌(C.globosum)和角毛壳菌(C.cupreum)用常规固体培养方法在PDA培养基(土豆200g去皮，切成1cm3小块，煮沸20‐30min，过滤，滤液加入葡萄糖10g，琼脂20g，用纯净水定容到1L，pH自然)中培养18天，待培养皿上部长满孢子，用结晶刀取出，分别将两种真菌配制成浓度为2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液各500mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 300mg，用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1.5mg/mL的IAA母液，备用。
待聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的9％PVP水溶液1000mL、球毛壳菌(C.globosum)2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液400mL、角毛壳菌(C.cupreum)2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液400mL和200mL浓度为1.5mg/mL的IAA混合，充分搅拌，使其混合均匀，即得新型三七种苗根系生物包衣剂。
将一年生三七种苗采挖出土，小心抖去根部泥土，蘸取上述配制所得的三七种苗根系生物包衣剂，再于通风、阴凉处摊晾2h，使包衣剂成膜，之后整齐地放入运输框中，次日种植于大田中。同时，于传统处理三七种苗方法，即：三七种苗采挖后用甲基硫菌灵100g，杀毒矾100g，菌核净80g，生根粉100g混匀，均匀撒在三七种苗的根系表面(药粉；种苗1：400)，进行大田移栽为对照进行观测和统计。各处理方式的实验种植面积分别为200m2，其他水肥等管理措施完全一致，结果如表1所示。(其中，对照组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培；对照组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培。
表1 不同处理三七种苗种植1年后的生长状况调查
从上述结果可以看出，采用本发明的三七种苗生物包衣剂，可以显著增加三七种苗的出苗率；显著降低立枯病和根腐病的发病率；显著增加二年生三七的存苗率，并增加三七头子的干重，有利于提高三七的产量和质量。
实施例2：
精密称取羟丙基甲基纤维素(HPMC)70g，加热水1000mL,搅拌使其充分溶解；活化后(菌种活化系指将低温保存的菌株置于常温条件下复苏，之后接种在固体培养基中，于25～28℃条件下进行继代培养2-3次，获得生长良好的菌落)的米修链霉菌(S.misionensis)和拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)用常规固体培养方法分别在海藻糖‐脯氨酸(S2)固体培养基(海藻糖5g，脯氨酸1g，(NH4)2SO4 1g，NaCl 1g，CaCl2 2g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，复合维生素：核黄素1mg、烟酸1mg、泛酸钙1mg、肌醇1mg、生物素1mg、P‐氨基苯甲酸1mg、VB11mg、VB6 1mg，琼脂20g，补水到1000mL，pH 7.2)和LB固体培养基(酵母粉5g，胰蛋白胨8g，NaCl4g，琼脂15g，pH 6.8)中增殖培养48h，待菌落布满整个培养皿，用结晶刀取出，分别将米修链霉菌(S.misionensis)和拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)配制成浓度为1.5х105CFU/mL的菌悬液各400mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 300mg,用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1.5mg/mL的IAA母液，备用。
待HPMC水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的7％HPMC水溶液1000mL、米修链霉菌(S.misionensis)1.5х105CFU/mL的菌悬浮液400mL和拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)1.5х105CFU/mL的菌悬浮液400mL和200mL浓度为1.5mg/mL的IAA混合，充分搅拌，使其混合均匀，即得新型三七种苗根系生物包衣剂。
将一年生三七种苗采挖出土，小心抖去根部泥土，蘸取上述配制所得的三七种苗根系生物包衣剂，再于通风、阴凉处摊晾2h，使包衣剂成膜，之后整齐地放入运输框中，次日种植于大田中。同时，于传统处理三七种苗方法，即：三七种苗采挖后用甲基硫菌灵100g，杀毒矾100g，菌核净80g，生根粉100g混匀，均匀撒在三七种苗的根系表面(药粉；种苗1：400)，进行大田移栽为对照进行观测和统计。各处理方式的实验种植面积分别为200m2，其他水肥等管理措施完全一致，结果如表2所示。(其中，对照组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培；对照组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培。
表2 不同处理三七种苗种植1年后的生长状况调查
从上述结果可以看出，采用本发明的三七种苗生物包衣剂，可以显著增加三七种苗的出苗率；显著降低立枯病和根腐病的发病率；显著增加二年生三七的存苗率，并增加三七头子的干重，有利于提高三七的产量和质量。
实施例3：
精密称取海藻酸钠80g，加热水1000mL，搅拌使其充分溶解；活化后(菌种活化系指将低温保存的菌株置于常温条件下复苏，之后接种在固体培养基中，于25～28℃条件下进行继代培养2-3次，获得生长良好的菌落)的球毛壳菌(C.globosum)、角毛壳菌(C.cupreum)用常规固体培养方法分别在PDA培养基(土豆200g去皮，切成1cm3小块，煮沸20‐30min，过滤，滤液加入葡萄糖10g，琼脂20g，用纯净水定容到1L，pH自然)中增殖培养18天待培养皿上部长满孢子，用结晶刀取出，分别将两种真菌配制成浓度为2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液各500mL；拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)在LB固体培养基(酵母粉5g，胰蛋白胨8g，NaCl 4g，琼脂15g，pH 6.8)中增殖培养48h，待菌落布满整个培养皿，用结晶刀取出，将拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)配制成浓度为1.5х105CFU/mL的菌悬液各400mL；精密称取三七根系生长促进剂吲哚乙酸IAA 200mg,用少量乙醇溶解后加水定容到200mL，配成浓度为1mg/mL的IAA母液，备用。
待海藻酸钠水溶液冷却至28～30℃时，将上述配制的8％海藻酸钠水溶液1000mL、球毛壳菌(C.globosum)2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液300mL、角毛壳菌(C.cupreum)2.0х105个孢子/mL的孢子悬浮液200mL和拟无枝酸杆菌(A.vancoresmycina)1.5х105CFU/mL的菌悬浮液300mL及200mL浓度为1mg/mL的IAA混合，充分搅拌，使其混合均匀，即得新型三七种苗根系生物包衣剂。
将一年生三七种苗采挖出土，小心抖去根部泥土，蘸取上述配制所得的三七种苗根系生物包衣剂，于通风、阴凉处摊晾2h，使包衣剂成膜，之后整齐地放入运输框中，次日种植于大田中。同时，于传统处理三七种苗方法，即：三七种苗采挖后用甲基硫菌灵100g，杀毒矾100g，菌核净80g，生根粉100g混匀，均匀撒在三七种苗的根系表面(药粉；种苗1：400)，进行大田移栽为对照进行观测和统计。各处理方式的实验种植面积分别为200m2，其他水肥等管理措施完全一致，结果如表3所示。(其中，对照组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅰ系指首次栽培三七的新地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培；对照组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中按传统三七种苗处理方式进行栽培；包衣组Ⅱ系指栽种过两年三七后轮作3年玉米的轮作地中用本发明的三七种苗生物包衣剂对三七种苗处理方式进行栽培。
表3 不同处理三七种苗种植1年后的生长状况调查
从上述结果可以看出，采用本发明的三七种苗生物包衣剂，可以显著增加三七种苗的出苗率；显著降低立枯病和根腐病的发病率；显著增加二年生三七的存苗率，并增加三七头子的干重，有利于提高三七的产量和质量。