一种采用生物反应器生产山参培养根的方法与流程

本发明涉及一种可用于食品和化妆品的原料,特别是涉及一种采用生物反应器快速大量地生产山参培养根的方法，属于植物组织培养的技术领域。

背景技术：

人参是应用历史最为久远的名贵中药，隶属于panax属。希腊文panax的含义就有“总的医疗”或“万能药”的意思，这说明人参具有被大家广泛认同对人体健康有益的多种功效。虽然在植物分类上，人参可分为十几个种，但最为被大众接受而食用的，只有高丽参(国内又称长白参或吉林参，panax.ginsengc.a.mayer)和西洋参(又名美国参或花旗参，p.quinguefoliusl.)。人参作为传统的滋补品，在世界范围内广受欢迎。我国于2012年8月29日正式将人参分类为保健食品，摆脱了以往“药食不能同源”的尴尬处境，

尽管对人参类产品的需求日益增高，但公认具有极好功效的野生人参已被确定为濒危物种，国际上已经严禁此类商品交易，另外来源稀少也不可能满足市场供应。人工种植人参是满足市场需求的最主要的来源，可是人参种植对地理位置和环境的要求较特殊，同时具有良好保健功效的人参需要种植六年以上且耕地不可连作，这些严重限制了人参产量供应；人工种植另一个无法避免的不足之处是种植过程中农药的使用和环境污染对土壤腐蚀而导致的重金属残留。我国建立的种植人参的国家标准中明确提到的农药残留量测定的种类已经达到十三种。

现代生物技术的发展，为人参培养提供了一种新的思路。这其中最被看好的一项技术就是人参不定根的组织培养，该项技术具有培养过程无农药、无重金属残留，不受自然环境限制，培养周期短(两个月)，功效成分及含量(人参皂甙)也与种植人参相似，适合工业化生产，产品种系纯净(与母本人参完全一致)等多项种植人参无法匹及的优势和特点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的利用生物反应器大量生产山参培养根的方法，所用的山参培养根是分离自百年野生山参，百年长白参或百年吉林参，百年野生山参在自然界难得一见，它的食、药用价值远远高于种植的人参，由此山参分离培养得到的山参培养根必然也会在遗传上获得母本山参中特有的稀缺营养、功效物质，因此通过本发明方法大量得到的山参培养根产品在营养、保健价值上要好于普通的种植人参。分离过程简述为切取野山参的根部组织块，无菌培养在含营养物的琼脂平皿上，通过诱导使其分化出愈伤组织，分离愈伤组织转接到新的营养琼脂平皿上，加入iba(吲哚丁酸)诱导愈伤组织分化出不定根组织，将来源不同愈伤组织的不定根分别收集并在三角摇瓶内扩增，将每种不定根均进行生物学特征鉴定，把有不同特色的不定根分别命名以示区别。

本发明选用的山参不定根，其特征在于生长过程可累积较高的人参皂甙含量，易于培养不需要特殊的营养要求，其总人参皂甙中人参三醇型(protopanaxtriol)的含量比例高，其中re和人参皂苷rg1两者的含量总和占总人参皂甙含量的50％以上，且人参总皂甙含量大于3％。此山参培养根是由韩国韩方生物(hanbangbio)庆熙大学技术支柱会社分离鉴定，并授权给本发明人生产使用。

具体制作方法为：

(4)将新鲜的山参培养根在含有蔗糖和iba(吲哚丁酸)的100～120ml优化过的schenk&hidebrandt(sh)液体培养基的三角瓶内震荡扩增培养，温度为16～26℃温度范围，时间为32～40天，至山参培养根充满整个三角瓶；

(5)经三角瓶培养得到的山参培养根后，收集瓶内的山参培养根，无菌接种到装有12～14升含有蔗糖和iba(吲哚丁酸)的优化过的schenk&hidebrandt(sh)液体培养基并灭菌后的气升式生物反应器内；

山参培养根在气升式生物反应器中培养的前28天内，培养温度控制范围在23～26℃，空气通气量控制范围在0.09～0.21m³/h；在29天至结束培养，培养温度范围调整为19～21℃，空气通气量范围调整为0.012～0.024m³/h；其中分别在第29天添加人参皂甙生成诱导剂，第35天添加生长促进剂；

(6)山参培养根在气升式生物反应器内生长至山参培养根长出新的根须充满气升式生物反应器，培养结束，将须状山参培养根收集后，用清水冲洗干净、浸泡5～10分钟去除残留培养基，再经80～90℃通风干燥20～24小时即获得山参培养根成品。

所述的气升式生物反应器为外形为圆筒状，内容积为18升；下口进气，上口排气，反应器摆放在支架上，每一支架可放18个反应器，称为一套为气升式反应器。

山参培养根在气升式生物反应器内生长天数为45～50。

山参培养根培养过程所使用的优化过的培养基为schenk&hidebrandt(sh)液体培养基的改良培养基，所有优化过的schenk&hidebrandt(sh)液体培养基营养成分的浓度为schenk&hidebrandt(sh)标准培养基的0.7～0.8倍，每升schenk&hidebrandt(sh)标准培养基的成分有2500mgkno3，300mgnh4h2po4，151.02mgcacl2，195.34mgmgso4，10.0mgmnso4·h2o，1.0mgki，0.10mgnamoo4·2h2o，1.0mgznso4·7h2o，0.20mgcuso4·5h2o，15.0mgfeso4·7h2o，20.0mgna2edta，1000mgmyo-inositol，5.0mgthiamine-hcl，0.50mgpyridoxine-hcl，5.0mgnicotinic-acid；山参培养根培养过程ph控制在5.7～5.9。

于步骤(2)中，第29天加入人参皂甙生成诱导剂，每12-14升的液体培养基中添加人参皂甙生成诱导剂，所述人参皂甙生成诱导剂为终浓度为50～100ppm的水杨酸，50～100μmol/l的亚麻酸，200～400ppm的透明质酸，200～400ppm的海藻多糖，摩尔浓度0.05～0.1％的聚乙二醇400，以上物质均溶入500ml的schenk&hidebrandt(sh)标准培养基中得到的人参皂甙生成诱导剂。此溶液为使用前配制，并经过0.22μm除菌膜过滤除菌。

步骤(2)中，第35天加入生长促进剂，每12-14升的培养体系中添加生长促进剂，所述的生长促进剂包括终浓度为200～400ppm生物素，10～16wt.％的蔗糖，溶入体积为500ml的磷酸钾缓冲液中得到的生长促进剂，ph控制在5.8～6.0,其中钾离子浓度为0.5～2.0mmol/l。此溶液为使用前配制，并经过0.22μm除菌膜过滤除菌。

得到的山参培养根成品及萃取物可用于食品领域所允许的辅助添加剂和化妆品领域。

所述的步骤(1)中的山参培养根初始接种培养根接入量为0.3～0.6克/瓶，步骤(2)在每个生物反应器中的山参培养根接种培养根接入量为150～250克，每个三角瓶和生物反应器中含有添加终质量浓度为3％-4％的蔗糖和终浓度为2～5ppm的iba(吲哚丁酸)的优化过的schenk&hidebrandt(sh)液体培养基。

经反应器培养获得经干燥的山参培养根成品，每个反应器最终可得到130～180克干重的山参培养根成品。所述的山参培养根是由生物反应器生产培养，反应器的材质为可耐受125℃蒸汽灭菌并对人体无害的塑料材质。

本发明的优势

人参不定根培养要实现产业化，需要解决批次产量稳定和主要功效成分人参皂甙的有效累积两个方面的问题。本发明给出的技术解决方案是:在自行设计的气升式反应器内无菌接种经三角摇瓶培养富集的山参培养根，在合适的温度和通气控制条件下，在优化过的定制培养基中快速生长繁殖，针对山参培养根在培养过程中不同时期又分别添加了生长促进剂和人参皂甙生成诱导剂，当生物反应器内培养结束后，山参培养根经清洗、干燥，最后获得大量山参培养根成品。

本发明提及的山参培养根是分离自百年野生山参，遗传上保留野生山参的特征，可通过核酸对照位点的单核苷酸多态性(snp，singlenucleotidepolymorphism)，进行区分和鉴定。

为更好的实现本发明的目的，培养使用的反应器是根据培养工艺和特点自行设计，反应器材质为可耐受125℃蒸汽灭菌的对人体无害的透明塑料材质，如聚丙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯。反应器外形为圆筒状，径高比为1:1.6～2.0，内容积为18升，有效使用体积为12～14升；为气升式反应器，下口进气，上口排气，反应器摆放在专用支架上，每一支架可放18个反应器，称为一套。

为更好的实现本发明的目的，所述步骤(1)、(2)中使用的培养基是经过优化的，在标准sh液体培养基的基础上进行了浓度比例的调整，

与现有同类技术相比,本发明的有益效果是：不同于种植人参，分离自具有极高食药用价值百年野生山参的不定根组织——山参培养根，带有独特的生物学特征，可通过单核苷酸多态性(snp，singlenucleotidepolymorphism)，进行区分和鉴定。优势特点集中在：(1)自行设计更符合工艺和生长特点的气升生物反应器；(2)在生物反应器内的培养过程，温度和通气控制参数均进行优化；(3)在生物反应器内的培养过程，添加经优选的生长促进剂和人参皂甙生成诱导剂，使得山参培养根的产量和人参总皂甙含量都有显著的提高；(4)每个18升的反应器可稳定生产出130～180克干重的山参培养根，总人参皂甙含量不低于3.0％，这一指标高于种植人参的同类指标。(5)与传统种植人参相比，本方法可显著提高人参的生产效率，同时也避免种植人参特有的农药残留、重金属超标的劣势，作为种植人参的替代和补充，有较好的经济和社会效益。，加工成有改善记忆力、延缓衰老、提高免疫力、调节血压血脂的功能性食品，也可加工成具有美白和祛皱效果的化妆品中

附图说明

图1：为野生山参、培养根和种植人参的特定基因片段的序列分析图；

图2：为野生山参、培养根和种植人参进行pcr扩增的原理示意图；

图3：为野生山参、培养根和种植人参的核酸电泳比对图；

图4：为添加生长促进剂对反应器中培养根的影响图；

图5：为添加人参皂甙生成诱导剂对反应器中培养根的影响图；

图6：是诱导得到的山参培养根图。

具体实施方式

为使本发明的优点和特点更加容易理解，下面通过一个对山参培养根的鉴别实例和两个用反应器优化生产山参培养根的实例，结合具体实施例的过程，进一步阐述本发明。但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。提到的诱导方法引用于安徽农业科学，journalofanhuiagri.sci.2015，43(12):48－50北沙参不定根诱导及悬浮培养研究李占东。

实施例1

对山参培养根的来源进行单核苷酸多态性(snp，singlenucleotidepolymorphism)的区分鉴定，主要是通过核酸片段的电泳结果与普通种植人参进行区分，同时也证实山参培养根确实来自母本百年野生山参。对三组分别为母本野山参、培养根和种植人参的等位核酸片段进行基因测序，发现在同一基因等位点，母本山参和由母本山参分离培养根的核酸序列是鸟嘌呤，而种植人参为腺嘌呤，根据此点的序列差异，我们设计了pcr扩增策略，母本野山参和培养根可扩增出三段核酸片段，而种植人参仅可扩增出两段核酸片段。通过后续的核酸电泳，可以清晰地区别两者的不同。

如图3所示，对电泳图谱结果的鉴别，可证实野生山参与种植山参的生物学特征差异，同时也可证实培养根是分离自母本百年野生山参。

本发明的山参培养根培养过程所使用的优化过的培养基为schenk&hidebrandt(sh)液体培养基的改良培养基，所有优化过的schenk&hidebrandt(sh)液体培养基营养成分的浓度为schenk&hidebrandt(sh)标准液体培养基的0.7～0.8倍，每升schenk&hidebrandt(sh)标准液体培养基的成分有2500mgkno3，300mgnh4h2po4，151.02mgcacl2，195.34mgmgso4，10.0mgmnso4·h2o，1.0mgki，0.10mgnamoo4·2h2o，1.0mgznso4·7h2o，0.20mgcuso4·5h2o，15.0mgfeso4·7h2o，20.0mgna2edta，1000mgmyo-inositol，5.0mgthiamine-hcl，0.50mgpyridoxine-hcl，5.0mgnicotinic-acid；山参培养根培养过程ph控制在5.7～5.9。

实施例2

具体制作过程为：

1.选择生物反应器：罐体积为18升的气升生物反应器，气升式生物反应器为外形为圆筒状，内容积为18升；下口进气，上口排气，反应器摆放在支架上，每一支架可放18个反应器，称为一套为气升式反应器。

2.0.4g新鲜山参培养根先在装有120ml的内添加蔗糖4.2克和终浓度3ppm的iba(吲哚丁酸)的优化过的sh液体培养基的三角瓶内震荡扩增培养35天，使山参培养根充满整个三角瓶。

3.经多个三角瓶同时培养获得足量的山参培养根，收集160克湿重培养根无菌接种到装有13升0.75倍浓度比例的sh标准液体培养基并预先湿热灭菌的生物反应器内；前28天培养温度范围严格控制在23～26℃，空气通气量范围严格控制在0.12～0.20m³/h,培养基中添加蔗糖浓度3.5％，iba浓度2.5ppm。

4.在生物反应器内培养至第29天，将培养温度范围调控到19～21℃，空气通气量调控到0.015～0.024m³/h；加入人参皂甙生成诱导剂，每13升的液体培养基中添加一定量的人参皂甙生成诱导剂，所述人参皂甙生成诱导剂为500ml含有终浓度为50～100ppm的水杨酸，50～100μmol/l的亚麻酸，200～400ppm的透明质酸，200～400ppm的海藻多糖和摩尔浓度0.05～0.1％的聚乙二醇400的schenk&hidebrandt(sh)标准培养基中。

5.在生物反应器内培养至第35天，添加500ml含有400ppm生物素，12％蔗糖的0.5mmol/l磷酸钾缓冲液，该缓冲液的ph控制在5.9，其中钾离子浓度为1.0mmol/l。

6.当生物反应器内培养至第45天，结束培养，收集须状培养根，经清水冲洗干净、浸泡10分钟左右去除残留培养基，后经90℃干燥20小时，获得山参培养根成品，记录此时的重量。对照组在35天未进行任何改变，一直维持控制条件为温度在23～26℃，通气量在0.12～0.20m³/h，直至第45天，也同样经过后续的洗涤和干燥，记录成品的重量。两个条件分别进行6次重复，结果如图4所示。收获的培养根的干重平均值由119g提高至152g，提高了27％。

表1.添加生长促进剂对山参培养根产量影响的比较

实施例3

1.选择生物反应器：罐体积为18升的气升生物反应器。

2.0.5g新鲜山参培养根先在装有120ml的优化过的sh液体培养基的三角瓶内震荡扩增培养32天，sh液体培养基内含有蔗糖4.8克和终浓度5ppm的iba(吲哚丁酸)。

3.经多个三角瓶同时培养获得足量的山参培养根，收集180克湿重培养根无菌接种到装有13升0.75倍浓度比例的sh培养基并预先湿热灭菌的生物反应器内；培养温度范围严格控制在23～26℃，空气通气量范围严格控制在0.10～0.20m³/h,培养基中蔗糖浓度3.5％，iba浓度3.0ppm。

4.在生物反应器内培养至第29天，将培养温度范围调控到19～21℃，空气通气量调控到0.012～0.02m³/h。

5.在生物反应器内培养至第29天，添加500ml含有100ppm的水杨酸，100μmol/l的亚麻酸，300ppm的透明质酸，300ppm的海藻多糖，0.1％的聚乙二醇400的sh培养基。

6.在生物反应器内培养至第35天，添加500ml含有400ppm生物素，12％蔗糖的0.5mmol/l磷酸钾缓冲液，该缓冲液的ph控制在5.9。

7.当生物反应器内培养至第48天，结束培养，收集须状培养根，经清水冲洗、浸泡8分钟去除残留培养基，后经90℃干燥20小时，获得山参培养根成品，根据gb/t19506-2009测定总皂甙含量。对照组一在29天和35天未进行任何改变，一直维持控制条件为温度在23～26℃，通气量在0.15～0.20m³/h，直至第48天，也同样经过后续的洗涤和干燥，测定并记录成品的总皂甙含量。对照组二在培养到第29天，将培养温度范围调控到19～21℃，空气通气量调控到0.012～0.02m³/h，但不添加任何人参皂甙生成诱导剂，在反应器内培养的第35天，添加500ml含有400ppm生物素，12％蔗糖的0.5mmol/l磷酸钾缓冲液，该缓冲液的ph控制在5.9，到第46天培养结束。与前两组的洗涤和干燥条件一致，收获得到山参培养根成品。三组条件分别进行6次重复，结果如图5所示。总皂甙含量平均值由2.30％提高至3.17％，提高了38％。而对照组一和对照组二的总皂甙含量平均值未有明显变化。

表2.添加人参皂甙生成诱导剂对山参培养根总皂甙含量影响的比较

本发明加入生长促进剂后，在与调整后的温度和通气量的协同作用下，明显提高山参培养根的产量。加入人参皂甙生成诱导剂后，在与调整后的温度和通气量的协同作用下，可以诱导山参培养根中人参皂甙的体内合成和累积，明显提高山参培养根在反应器中生长结束时的总皂甙含量。得到山参培养根可用于食品和化妆品领域，可加工成有改善记忆力、延缓衰老、提高免疫力、调节血压血脂的功能性食品，也可加工成具有美白和祛皱效果的化妆品。