大叶芳樟的组织培养和快速繁殖方法与流程

本发明涉及组培快繁技术领域，具体涉及一种大叶芳樟的组织培养和快速繁殖方法。

背景技术：

大叶芳樟(Cinnamomum camphora)，樟科樟属，是黄樟的一个特异生理类型，1990年代华南植物研究所朱亮锋研究员在广东省境内首次发现，其叶揉之具有浓烈芳樟醇香气。为亚热带常绿阔叶林的代表树种，主要产地是中国台湾、福建、江西、广东、广西、湖南、湖北、云南和浙江等地，是中国南方珍贵用材和特用经济树种。因其寿命长、树姿雄伟、四季常青，观赏性较好，有极好的园林绿化价值，自古以来就深受广大人民喜爱；大叶芳樟存活期长，可以生长为成百上千年的参天古木，有很强的吸烟滞尘、涵养水源、固土防沙和美化环境的能力。其木材纹理细致，比重0.53-0.64，不变形，耐虫蛀，有淡淡的香辣芳香气味，易加工，是一种很好的建筑和家具用材，成为各种名贵木材之一；木材、枝、根、叶均可提制樟脑，樟油，供医药、化工、香料、防腐、杀虫等用。种子含油脂，可榨油，为制皂良好原料。

芳樟是香樟五个天然类型中含芳樟醇最高的一种，芳樟醇及其相应的衍生物是香化工业的主要原料，在全世界需求极大，但天然香樟醇只占极少部分，而合成的芳樟醇在气味，香韵，甜润等主要物化性能上比天然香樟醇相差甚远，因此，市场对优良大叶芳樟苗木需求极大。而如何保证其品种纯正的情况下又能短时间内提供大量齐整的优良大叶芳樟苗称为行业亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种保证品种纯正的情况下又能短时间内提供大量齐整的大叶芳樟苗的大叶芳樟的组织培养和快速繁殖方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种大叶芳樟的组织培养和快速繁殖方法，步骤包括：

(1)取多年生优良大叶芳樟母株当年萌发的嫩枝条，切成0.5-1.5cm长带腋芽的小段，用密闭容器装好后放入冰箱冷藏室10-15h，取出用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30-50min；再用70％的酒精浸润0.3-0.8min，无菌水冲洗2—3次；用0.1％-0.2％的升汞消毒6-12min，无菌水冲洗3--5次；

(2)用滤纸吸干水后接种至MS培养基中，经36-42天后腋芽长至0.5-1cm；将腋芽挑下接种至MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L的培养基中暗培养18-25天后其基部形成淡黄偏绿色，疏密程度适中的质量好的愈伤组织，把愈伤组织接入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中，12-18天后出现丛状小芽团；

(3)25-35天后把丛状小芽团按照3—5个芽/团的标准进行分切，然后转入MS+6-BA0.2-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中，以30天为一个周期续代一次，续代一次产生5--8个子芽/团；

(5)增殖培养基续代3-5代后，将芽团中H(高度)＞2.5cm的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中15—20天后根开始萌动，40—45d后有95％的苗生出2-3条长0.4-0.6cm的根即完成苗的繁殖。

上述方法还包括移植步骤：将已生根的小苗放入荫棚内炼苗约10天(d)，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗很快正常生长。

以上培养基均用纯水，含蔗糖3％，卡拉胶0.75％，PH值5.8，培养温度24--26℃，光照10—12h/d，光强1500—2000lx。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明通过特定的培养基和组成，以及培养光照时间、pH等的控制，在短时间内即可获得品种纯正、齐整的大叶芳樟苗；因此是制备芳樟的优良方法。此外方法简单、通过组织培养稳定性强，对设备的要求较低，生产出的苗遗传性好。本发明采用嫩枝条作为诱导对象，易于获取，保证了周期短，生根率高，易成活；本发明的结果表明，在培养条件：培养基均用纯水，含蔗糖3％，卡拉胶0.75％，PH值5.8，培养温度24--26℃，光照10—12h/d，光强1500—2000lx条件下，95％的苗能生出2-3条长0.4-0.6cm的根。

2.将已生根的小苗放入荫棚内炼苗约10天(d)，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗很快正常生长，成活率85％以上

附图说明

附图1本发明芽诱导过程中的腋芽。

附图2本发明芽诱导过程中的愈伤和芽。

附图3本发明芽的增值过程的增殖芽团(I)。

附图4本发明芽的增值过程的增殖芽团(II)。

附图5本发明芽的增值过程的增殖芽团(III)。

附图6本发明芽的增值过程的节段成团。

附图7本发明根的诱导过程中的待生根苗。‘

附图8本发明根的诱导过程中的生根苗。

附图9本发明根的诱导过程中的生根苗(I)。

附图10本发明根的诱导过程中的生根苗(II)。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例

1.试验材料和方法

取多年生优良大叶芳樟母株当年萌发的嫩枝条，切成约1cm长带腋芽的小段。注意不可用生锈的手术刀并要减少伤口在空气中暴露的时间，否则茎段会由于多酚氧化酶等的氧化作用而切口褐化，增加制种难度。采回的茎段用密闭容器装好后放入冰箱冷藏室约12h后用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30min以上。后用70％的酒精浸润约0.5min，无菌水冲洗2—3次。再视材料大小，老嫩程度分别用0.1％和0.2％的升汞消毒6--10min和8--12min，无菌水冲洗3--5次，用滤纸吸干水后接种至MS基本培养基中，经40d后消毒成功的腋芽长至约0.5-1cm。将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中暗培养约20d后其基部形成淡黄偏绿色，疏密程度适中的质量好的愈伤组织，把愈伤组织接入MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中，约15d后出现丛状小芽，30d后把芽团分切成3—5个芽/团继代培养。

以上培养基均用纯水，含蔗糖3％，卡拉胶0.75％，PH值5.8。培养温度24--26℃，光照10—12h/d，光强1500—2000lx。

2愈伤组织和芽的诱导

培养基配方是否适当直接影响外植体的分化与生长，各种生长调节剂的配比显得尤为关键。本实验将长约0.5-1cm的腋芽为1个增殖单位接种到诱导愈伤培养基中。试验结果见表1(基本培养基MS)

表1不同激素配比对愈伤组织诱导试验结果

从表1可知：腋芽对6-BA比对KT和2ip更敏感，KT和2ip所使用浓度虽和6-BA一样高，但形成愈伤率却低很多。6-BA又以4号培养基为最好，所形成愈伤质量很高。5号，6号培养基形成的愈伤数虽比4号多，但部分愈伤呈白色蓬松状，是无效愈伤，尤其6号形成愈伤呈现出水浸状玻璃化，质量不高。添加NAA比IAA形成愈伤组织的比例更高，，具体结果见附图1-2。

3芽的诱导

将诱导出的愈伤组织分切成0.2-0.3cm左右的小团块，接种到诱导芽的培养基中。试验结果见表2(基本培养基MS)

表2不同激素组合对芽诱导试验结果

综合以上数据分析，细胞分裂素2ip，6-KT，6-BA均能从愈伤组织中诱出芽，6-BA又以0.3mg/L为佳，较低浓度则芽偏少，较高浓度愈伤组织又变差，影响下代增殖率。生长素方面从数据上看NAA要略优于IAA。综上以d号培养基为最好，芽最多，愈伤组织虽增大明显且其质量并没有变差，，具体结果见附图3-6。

4.芽的增殖

将诱导出的小芽丛带少许愈伤分成2--3个芽/团，转入优选出的增殖培养基中，各处理详见表3，以30d为一个周期续代一次可产生5--8个子芽，6-BA的浓度在一定的范围内浓度越高，子芽也越多，但浓度太高其增殖率反而会下降。而且随着6-BA浓度的升高，叶片会变尖且苗的基部会出现较多无效愈伤，反而影响其增殖率。因此，在续代过程中要密切观察苗况，随时调整6-BA的浓度，以确保在保证增殖苗质量的前提下尽可能的提高其扩繁系数。而索长江等通过实验则认为MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L增殖效果较好。彭东辉则认为MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.2mg/L增殖效果较好；本发明实施例采用的培养基见表3，从中筛选最优选配比。

另：在用选取的增殖培养基续代3--5代后，从芽团上选取H＞2.5CM的粗壮单株将其茎段分成约0.3cm/段的节段用较高浓度的6-BA培养基使其成团扩繁，以50d为周期。各处理详见表4，因每株单株茎段可分4-7个节段，因此其增殖率可成倍增加且苗的质量经多代观察可以保证。从而达到大量生产且持续稳定出苗的目的。

表3芽团在增殖培养基各处理中的生长表现

综合以上数据分析，A,B,C号处理均可用于芽团增殖扩繁，具体选用可视苗况而定，亦可交叉使用。D,E处理苗况不好，不宜使用。

表4粗壮单株分段在增殖培养基各处理中的生长表现

综合以上数据看出，3号处理培养基用于节段成团增殖扩繁最好，具体可见附图7-8。

5根的诱导

将芽团中H＞2.5cm的粗壮单芽挑下，接入生根培养基中，在优选培养基中15—20d后根开始萌动，40—45d后有95％的苗生出2-3条长约0.5cm的根。具体不同培养基生根情况见表5：

表5不同培养基生根情况

综合以上数据分析，c号处理培养基用于达标苗生根最好。生根培养基不宜添加生长素NAA，否则苗基部或根茎交接处易产生愈伤组织，使生根率降低并影响生根质量。而吴金寿等通过实验则认为1/2MS+IBA0.8mg/L+NAA0.2mg/L生根效果较好，具体可见附图7-8。

6.移植：将已生根的小苗放入荫棚内炼苗约10d，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗很快正常生长，成活率85％以上；移植后生长状态见附图9-10。