本发明涉及一种利用结缕草属植物叶基诱导愈伤组织的方法，属于结缕草属植物组织培养技术领域。
背景技术：
结缕草属植物作为一种在全球范围内分布较广的暖季型草坪草植物，它具有耐践踏、抗旱、综合适应能力强、耐粗放管理、生态环保等优点。马尼拉结缕草及中华结缕草是我国目前使用较多的结缕草属植物，然而草坪草多为单子叶草本植物，分化增殖都不是那么容易，结缕草作为典型的暖季型草坪草，很难诱导愈伤组织，导致以愈伤组织诱导为基础的组织培养植株再生及遗传转化等很难进行。
目前，虽然也有结缕草属植物愈伤组织诱导成功的报道，但所选外植体以匍匐茎为主，结缕草属植物匍匐茎相对植株其他部分，可采集的数量少，只在高温高湿季节，有适当扩展，且愈伤诱导限新生匍匐茎，外植体可供采集的时间和数量受到极大的限制，且愈伤组织诱导率较低。
技术实现要素：
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供利用结缕草属植物叶基诱导愈伤组
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明公开了一种利用结缕草属植物叶基诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)培养基的配制：选择基础培养基，加入蔗糖和琼脂，再加入6-苄氨基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值，灭菌，即得；
(2)外植体处理：选取健康无病害的结缕草属植物直立植，取顶部向基部成熟叶，取顶部起1-4片健康叶片，清洗，消毒；
(3)修剪：剪取叶片基部，即剪下叶片基部，整个叶片的下部1/3处；
(4)接种培养：将步骤(3)剪裁好的叶片基部，接种到步骤(1)所得培养基中，置于无菌培养室内培养。
作为优选，所述步骤(1)中基础培养基为MS培养基。
作为另一种优选，所述步骤(1)中蔗糖和琼脂的浓度分别为30g/L和7g/L。
作为另一种优选，所述步骤(1)中6-苄氨基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸的浓度分别为0.1mg/L和2.0-3.0mg/L。
作为另一种优选，所述步骤(1)中pH值为5.8，灭菌条件为：121℃高压下灭菌25min。
作为另一种优选，所述步骤(2)中清洗方法为：先用纯水冲洗，再用洗衣粉加水浸泡20分钟，再用纯水冲洗20分钟。
作为另一种优选，所述步骤(2)中消毒方法为：先用95％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡3-5分钟，最后用无菌水冲洗5次。
作为另一种优选，所述步骤(4)中无菌培养室的培养条件为：温度25±2℃，环境湿度70-80％，光照强度2000-3000lx，14h光周期。
作为另一种优选，所述结缕草属植物为马尼拉结缕草或中华结缕草。
技术效果：相对于现有技术，本发明以叶基为外植体进行愈伤诱导，其优点主要有以下几点：1、叶片数量多，可供采集的适宜外植体量多；2、外植体供采集的时间长；3、愈伤组织的诱导率高。
具体实施方式
实施例1
选择马尼拉结缕草进行诱导愈伤组织，方法如下：
(1)培养基的配制：选择MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，其浓度分别为30g/L和7g/L；再加入6-苄氨基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，其浓度分别为0.1mg/L和2.0mg/L；调节pH值为5.8，121℃高压下灭菌25min，即得；
(2)外植体处理：选取健康无病害的结缕草属植物直立植，取顶部向基部成熟叶，取顶部起1-4片健康叶片，先用纯水冲洗，再用洗衣粉加水浸泡20分钟，再用纯水冲洗20分钟；消毒：先用95％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡3分钟，最后用无菌水冲洗5次；
(3)修剪：剪取叶片基部，即剪下叶片基部，整个叶片的下部1/3处；
(4)接种培养：将步骤(3)剪裁好的叶片基部，接种到步骤(1)所得培养基中，置于无菌培养室内培养，培养条件为：温度25±2℃，环境湿度70％，光照强度2000lx，14h光周期。
实施例2：
选择中华结缕草进行诱导愈伤组织，方法如下：
(1)培养基的配制：选择MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，其浓度分别为30g/L和7g/L；再加入6-苄氨基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，其浓度分别为0.1mg/L和3.0mg/L；调节pH值为5.8，121℃高压下灭菌25min，即得；
(2)外植体处理：选取健康无病害的结缕草属植物直立植，取顶部向基部成熟叶，取顶部起1-4片健康叶片，先用纯水冲洗，再用洗衣粉加水浸泡20分钟，再用纯水冲洗20分钟；消毒：先用95％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡5分钟，最后用无菌水冲洗5次；
(3)修剪：剪取叶片基部，即剪下叶片基部，整个叶片的下部1/3处；
(4)接种培养：将步骤(3)剪裁好的叶片基部，接种到步骤(1)所得培养基中，置于无菌培养室内培养，培养条件为：温度25±2℃，环境湿度80％，光照强度3000lx，14h光周期。
实施例3：
选择中华结缕草进行诱导愈伤组织，方法如下：
(1)培养基的配制：选择MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，其浓度分别为30g/L和7g/L；再加入6-苄氨基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，其浓度分别为0.1mg/L和2.5mg/L；调节pH值为5.8，121℃高压下灭菌25min，即得；
(2)外植体处理：选取健康无病害的结缕草属植物直立植，取顶部向基部成熟叶，取顶部起1-4片健康叶片，先用纯水冲洗，再用洗衣粉加水浸泡20分钟，再用纯水冲洗20分钟；消毒：先用95％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡4分钟，最后用无菌水冲洗5次；
(3)修剪：剪取叶片基部，即剪下叶片基部，整个叶片的下部1/3处；
(4)接种培养：将步骤(3)剪裁好的叶片基部，接种到步骤(1)所得培养基中，置于无菌培养室内培养，培养条件为：温度25±2℃，环境湿度75％，光照强度2500lx，14h光周期。
本发明方法培养结果考察
选取同一批次的马尼拉结缕草和中华结缕草进行组织培养试验，分别按照本发明上述实施例1-3方法进行培养；
取上述相同批次的马尼拉结缕草，按照现有常规技术，外植体选择以匍匐茎来进行诱导愈伤组织培养，设为对照1组。
取上述相同批次的中华结缕草，按照本发明实施例3方法进行诱导愈伤组织培养，不同之处仅在于：将培养基中的2,4-二氯苯氧乙酸替换为反式玉米素核苷，设为对照2组；
各组分别培养2周后，对外植体的出愈率进行统计，结果下见表1
表1各组外植体出愈率
由上表1结果可得，相比较现有的以匍匐茎来进行诱导愈伤组织培养方法，以及采用不同激素，本发明方法能够显著提高马尼拉结缕草或者中华结缕草的出愈率，并且显著降低污染率和死亡率，培养效果显著。