本发明涉及植物组织培养技术领域，具体指一种铁皮石斛类原球茎培养方法。
背景技术：
铁皮石斛(dendrobiumcandidumwall.exlindl.)为兰科(orchidaceae)石斛属(dendrobium)多年生附生草本植物，因老茎茎节处呈褐色，又名黑节草，是一种集观赏和药用于一身的名贵珍稀草本植物，具有独特的药用价值，为石斛之极品。石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，其性味甘淡、微咸，性属清润，清中有补，补中有清。早在东汉时期的《神农本草经》中已记载石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，为历代帝王梦寐以求的宝物，素有“千金草”之称，驰名中外，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”，民间称其为“救命仙草”。现代药理学研究表明，石斛多糖具有增强t细胞及巨噬细胞免疫活性的作用，是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。
铁皮石斛常附生于树木或岩石上，植株比较矮小，生长发育缓慢，叶片面积小、光合面积小、强度低，尤其是种子极小，胚具后熟现象，因此自然条件下种子难以萌发(萌发率低于5％)。在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要3～4年，常需与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。
国内外学者开展了对野生铁皮石斛全面的研究，包括化学成分，药理活性，人工种植等方面的研究。而铁皮石斛的培养主要集中在愈伤组织诱导、基本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。铁皮石斛试管苗的繁殖一般要经过类原球茎(protocorm-likebodies，即plbs)阶段，而类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与原植株相同的物质代谢和形态发育潜能。鉴于此，人们提出用类原球茎代替原植株成为新药源的可能性。然而，已有的研究结果表明，从铁皮石斛不同部位诱导出类原球茎的研究还存在诱导率低、分化快和褐变等问题尚没有解决，目前还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决铁皮石斛类原球茎诱导和增殖以及代谢产物控制中存在的疑点和难点，从而影响了铁皮石斛的深入研究和开发。
天然铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此研究铁皮石斛类原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种铁皮石斛类原球茎培养方法，繁殖速度快，石斛多糖含量高。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入40～100g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
作为优选，所述步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为0.5cc/min～2.0cc/min。
作为优选，所述步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，每18d取出原培养液，并添加新鲜的培养液。
作为优选，所述步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，每18d向反应器内添加新鲜的培养液。
作为优选，所述步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，所述的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；所述的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
本发明具有以下的特点和有益效果：
采用上述技术方案，该方法容易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生产。通过在反应器内接入合适的铁皮石斛plbs、向培养液通入合适的通气量、以及增加新鲜培养液，和野生铁皮石斛比较石斛多糖含量提高大大提高。通过本发明方法生产铁皮石斛类原球茎，不变性，产量大，成本低，周期短，极具市场竞争力。
具体实施方式
下面结合对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入40g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
进一步的，步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
实施例3
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入100g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
综合实施例1至实施例3，
试验结果证实：相同的条件下，接种量为80g/l时多糖含量最高。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为0.5cc/min。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
实施例5
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为1.0cc/min。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
实施例6
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为2.0cc/min。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
综合实施例4至实施例6，
试验结果证实：相同的条件下，培养期间，通气量保持在2.0cc/min时多糖含量最高。
实施例7
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为2.0cc/min。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，每18d取出原培养液，并添加新鲜的培养液。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
实施例8
本发明提供了一种铁皮石斛类原球茎培养方法，包括以下步骤：
(1)制作培养液
以ms为基本培养基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值为5.6；
(2)培养液无菌处理
将培养液放入110～130℃高温高压灭菌锅内灭菌持续20min灭菌；
(3)铁皮石斛plbs培养
在5l的反应器中加入1l培养液，并处于25±2℃的温度环境下，接入80g铁皮石斛plbs，培养时间为36d；
(4)获取铁皮石斛plbs
培养36d后取出plbs称取鲜重，随后，将新鲜plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重复处理步骤(1)-(4)3次。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，向培养液通气，通气量为2.0cc/min。
步骤(3)中，在铁皮石斛plbs培养期间，每18d向反应器内添加新鲜的培养液。
步骤(3)包括丛生芽诱导培养期和大规模培养期，的丛生芽诱导培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s；的大规模培养：培养周期：15～20天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～20小时/天，光照强度：50～80μmol/m2·s。
综合实施例4至实施例6，
试验结果证实：相同的条件下，培养期间，每18d加1l培养液时多糖含量最高。
以上结合本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。