石斛育苗方法与流程

本发明涉及组织培养
技术领域：
，特别涉及一种石斛育苗方法。
背景技术：
：石斛在我国是一大类传统名贵中药材，传统上既可做药用，又可作保健品用，同时，从很久以前开始到现在还一直被作为一种高档汤料(食品)使用，目前石斛传统的药用和保健功能已得到人们的高度认同与喜爱。由于石斛在自然条件下需要和真菌共生提供营养才能萌发，且萌发率极低，野生石斛喜阴凉，湿润，通风多雾的气候环境，对生长环境极为苛刻，遇强光、暴雨、寒潮、干旱即会死亡，是一种生长缓慢，自身繁殖能力非常低的兰科附身植物，由于石斛具有巨大的药用和保健价值，导致长期掠夺性采挖，再加上生存环境越来越恶劣，致使野生资源严重枯竭。现如今石斛繁殖技术有种子萌发，扦插、分株繁殖，组织培养，其中种子萌发萌发率极低，扦插、分株繁殖繁殖速度也很慢。组织快繁技术是一种有效提高种苗生产效率的方法，运用组织培养进行石斛的培育能大大提高石斛的繁殖效率。目前生产上大多采用愈伤组织诱导来进行扩繁，但都是在激素配比上进行调试，然而，激素配比调试难以满足石斛所需最佳条件，从而导致出芽率较低。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种石斛育苗方法，旨在提高石斛育苗的出芽率。为实现上述目的，本发明提出一种石斛育苗方法，包括以下步骤：a、将带节的石斛茎段在培养基中培养，诱导腋芽；b、待腋芽生长高度超过1cm时，将芽点切除，诱导丛生芽；c、待众生芽生长达到1cm～2cm时，切割丛生芽，丛生芽进行增值及生根培养，并将切割完丛生芽的原茎段继续在培养基中培养，诱导愈伤组织；d、当愈伤组织形成后，将愈伤组织切割并转入培养基中继续培养，诱导丛生芽；e、将丛生芽转入培养基中增殖培养；f、当丛生芽生长高度达到2cm～3cm时，将其转入培养基中进行生根培养。优选的，上述步骤b还包括：在切除芽点时，保留0.1cm～0.5cm的芽点在茎段上。优选的，上述步骤b还包括：在切除芽点后，对保留的芽点的切面上进行纵切。优选的，步骤a中选取的茎段为石斛的靠近根部的茎段。优选的，上述步骤a还包括：在培养基培养之前，对茎段进行消毒、杀菌处理。优选的，对步骤a中培养基的配方为：MS，NAA：0.4mg/L～0.6mg/L，碳粉：0.2～1.0g/L，6-BA：1.0mg/L～2.0mg/L，KT：0.2mg/L～0.4mg/L，香蕉：10g/L～25g/L。优选的，对步骤c中培养基的配方为：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：0.3mg/L～0.4mg/L，6-BA：0mg/L～2.0mg/L，KT：0.1mg/L～0.3mg/L，碳粉：0.2～1.0g/L。优选的，步骤d中培养基的配方为：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：1.0mg/L～1.2mg/L，6-BA：1.5mg/L～1.7mg/L。优选的，步骤e中培养基的配方为：1/2MS培养基，香蕉：100g/L～120g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：0.5mg/L～1.5mg/L，IBA：0.5mg/L～1.0mg/L。本发明的技术方案通过芽点切割以打破顶端优势，促进萌发更多的丛生芽，缩短培养周期，并通过丛生芽的切割，以促进诱导愈伤组织的形成，利用愈伤组织进行扩繁，可以有效的增加扩繁数量，从而能生产出大量优质的石斛苗。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为霍山石斛增殖培养约60d后的分蘖数；图2为霍山石斛增殖培养60d后的生长值；图3为霍山石斛通过土豆处理后的生根培养株高图；图4为霍山石斛通过土豆处理后的生根培养茎粗图；图5为霍山石斛通过土豆处理后的生根培养根数图；图6为霍山石斛通过土豆处理后的生根培养根粗图；图7为霍山石斛通过香蕉处理后的生根培养株高图；图8为霍山石斛通过香蕉处理后的生根培养茎粗图；图9为霍山石斛通过香蕉处理后的生根培养根数图；图10为霍山石斛通过香蕉处理后的生根培养根粗图。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。本发明提出一种石斛育苗方法。在本发明实施例中，石斛育苗方法包括以下步骤：a、将带节的石斛茎段在培养基中培养，诱导腋芽。选择粗壮，胶质含量高，无病虫害的霍山石斛植株，去除叶片，洗洁精清洗干净，流水冲洗大约1小时，蒸馏水清洗干净，在超净工作台上用70％酒精搽拭干净，去除叶鞘，并将石斛鲜条切成大约1.5cm的带节茎段。然后通过大约0.1％升汞浸泡5min-8min，再用10％左右的次氯酸钠溶液消毒8min，用无菌水冲洗5-6次。最后将茎段平放接种于培养基中培养大约15天。b、待腋芽生长高度超过1cm时，将芽点切除，诱导丛生芽。在步骤a中，茎段经过15天培养，节点处长出高约1cm的奶绿色芽点，此时进行切割芽点。具体操作如下：①、用刀片将芽点割下，也就是去除顶芽，除去顶端优势；而后将其接种到培养基中。需要说明的是，在切割时，不能将芽点完全割完，应保留约0.1cm～0.5cm左右的芽点在茎段上，例如包括0.3cm。为了验证芽点保留长度与丛生芽的数量的关系，实验数表如下：芽点保留长度(cm)30个茎段，15d后丛生芽平均数量00.20.14.60.25.60.35.50.45.30.54.90.63.50.72.7由此，可见，当芽点保留长度在0.1～0.5cm时，丛生芽的数量最多。当芽点全部被切除后，几乎没有丛生芽。当芽点保留长度超过0.6cm时，显然丛生芽的数量较少，诱导效果不明显。②、用刀片在保留的芽点的切面上纵切一刀，以增加切口面积，提高愈伤组织成功率。而后继续放入原培养基中培养约25天。c、待众生芽生长达到1cm～2cm时，切割丛生芽，并将切割完丛生芽的原茎段继续在培养基中培养，诱导愈伤组织。经过25天左右培养，茎段切口处长出4-6棵丛生芽，高约1-2cm左右，此时要切割丛生芽。步操如下：丛生芽增殖：将切割下的丛生芽转入培养基中进行培养60天。60天后通过培养基进行生根培养。愈伤组织诱导：将切割完丛生芽的原诱导茎段继续放入培养基中诱导愈伤组织。d、当愈伤组织形成后，将愈伤组织切割并转入培养基中继续培养，诱导丛生芽。经过大约30天的培养，茎段切口已产生愈伤组织，部分愈伤组织已分化出丛生芽，平均一个茎段产生丛生小芽6-8棵左右，将愈伤组织用刀切成小块继续培养基中。再经过大约30天的培养，茎段丛生芽数量激增，愈伤组织已全部分化出芽，变成丛生芽簇，高度大概1cm左右，此时将丛生芽切出转接以进行增殖培养，愈伤组织可继续转入培养基进行丛生芽诱导培养。e、将丛生芽转入培养基中增殖培养。为了提高出芽数量，将上一步骤中的众生芽转入培养基中进行增殖培养，以得到更多的众生芽。f、当丛生芽生长高度达到2cm～3cm时，将其转入培养基中进行生根培养。通过步骤e的培养，培养大约60天后石斛苗足够健壮，高度大概2-3cm左右，可进行生根培养。将培养出的石斛小苗转入培养基中进行生根。g、出苗。石斛小苗在培养生根培养约75天后，石斛苗长出根系，石斛根达5cm左右且根，发绿，石斛苗达到7-8cm以上，长出叶片5片以上，叶色浓绿，即可移出室外炼苗移栽。本发明的技术方案通过芽点切割以打破顶端优势，促进萌发更多的丛生芽，缩短培养周期，并通过丛生芽的切割，以促进诱导愈伤组织的形成，利用愈伤组织进行扩繁，可以有效的增加扩繁数量，从而能生产出大量优质的石斛苗。石斛条上部生长素含量较高，理论上，在选取茎段时，应当优先选取上部，以在培养时生长出更多的丛生芽。为了验证石斛条个个位置的茎段对丛生芽数量的影响，选取霍山石斛为材料，实验数表如下：由此可见，对于霍山石斛而言，并不是上部茎段产生的丛生芽数量最对，相反，靠近根部茎段产生的丛生芽数量更多，这与技术人员的认知恰恰相反。因此，在选取石斛茎段时，优选靠近根部的茎段。下述内容中，将以石斛中的一种，霍山石斛的培育为例进行阐述。在上述步骤a中，虽然培育石斛茎段的培养基可以有多种，但是，在本实施例中，通过实验，得出较佳的M1培养基配方。实验如下：以MS为基本培养基，添加香蕉10g/L～25g/L(为石斛提供各种营养元素，例如氨基酸和微量元素等)，NAA，碳粉，KT、6-BA，配置9种不同激素配比的培养基，具体激素配方如表一：表一茎段诱导丛生芽培养基配方表40d后统计观察可得(表二)，从接种的9种培养基来看，9号培养基即激素配比为6-BA2mg/L+KT0.4mg/L的腋芽诱导率最高，诱导的腋芽达到102个，诱导的芽叶色浓绿、粗壮，高度最高。其次是6号培养基即激素配比为6-BA1mg/L+KT0.4mg/L，诱导的腋芽数为90个，诱导的芽叶色绿色、较粗壮。再次是处理5即激素配比为6-BA1mg/L+KT0.2mg/L。最差的是1、2、7号培养基，基本不萌发腋芽，只有少数萌发腋芽且萌发腋芽数较少，腋芽细弱，长势较弱，只有极少数有萌发现象且健壮度较弱，不适合进行下一步的转接。因此1、2、7号培养基不适合作为霍山石斛茎段诱导丛生芽培养基。表二茎段诱导丛生芽60d统计表++++非常健壮；+++健壮；++一般健壮；+弱带节茎段需要在细胞分裂素与生长素的共同作用下才能萌发出较理想的腋芽。在一定范围内，较高浓度的细胞分裂素KT和6-BA与较低浓度的NAA协同有利于芽的诱导，激素浓度过高或过低都不利于腋芽的诱导萌发，6-BA浓度一定的情况下，一定范围内KT越高茎段诱导腋芽数越多。综合考虑，霍山石斛茎段诱导丛生芽的较适培养基为基本培养基为:MS，NAA：0.4mg/L～0.6mg/L，6-BA：1.0mg/L～2.0mg/L，KT：0.2mg/L～0.4mg/L，香蕉：10g/L～25g/L。此时将丛生芽切下进行增殖培养，剩余的茎段进行愈伤组织的诱导。在此需要说明的是，由于茎段在培养过程中容易褐变的，因为培养基中其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应，而褐变会引起茎段发芽。添加一定量的碳粉，可有效防止褐变，从而提高从生芽的出芽率，在此，碳粉添加量在0.2～1.0g/L范围内，例如0.3g/L、0.5g/L或0.8g/L。为了防止褐变，下述其它实施例中将一并加入碳粉。因此，霍山石斛的基本培养基M1为：MS，NAA：0.4mg/L～0.6mg/L，6-BA：1.0mg/L～2.0mg/L，KT：0.2mg/L～0.4mg/L，香蕉：10g/L～25g/L，碳粉：0.2g/L～1.0g/L。在上述步骤c中，通过正交设计，得出较佳的M3培养基配方。设计三因素三水平正交实验，各因素表为表三，正交实验表为表四，基本培养基为花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L。将第一步实验剩余的茎段接种于正交实验表中的9个处理中，每个处理接种5瓶，每瓶接种5个茎段，30d时观察愈伤组织诱导数，60d后观察愈伤组织诱导芽数。表三因素水平表表四愈伤组织诱导正交实验表30d后各个观察可得各个处理均有产生愈伤组织，继续培养60d后发现愈伤组织均已产生不定芽，实验结果如表五。通过正交实验分析可得，个因素适宜的水平为，NAA：0.3mg/L，6-BA：1mg/L，KT：0.3mg/L，且个因素影响大小为NAA>KT>6-BA。因此适宜的茎段诱导愈伤组织的M3培养基配方为：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：0.3mg/L左右，6-BA：0mg/L～2.0mg/L，KT：0.1mg/L～0.3mg/L，碳粉：0.2～1.0g/L。表五愈伤组织诱导实验结果表六愈伤组织诱导实验结果通过表六，可以得出，NAA在0.3mg/L～0.4mg/L时，愈伤组织诱导数和不定芽平均诱导数最高，因此，M3培养基配方为：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：0.3mg/L～0.4mg/L，6-BA：0mg/L～2.0mg/L，KT：0.1mg/L～0.3mg/L，碳粉：0.2～1.0g/L。在上述步骤e中，通过正交设计，得出较佳的M2培养基配方。基本培养基为：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L。添加不同浓度的NAA、6-BA、配置9个不同激素配比的增殖培养基，培养基配方如表五，将高度一致，约为1cm的增殖苗接种于这9个不同处理的培养基中，每个处理接种20瓶，每瓶接种5棵霍山石斛增殖苗，大约60d后统计观察并记录小苗分蘖棵数、生长值、颜色、生长势。生长势：+长势较弱，颜色较黄，苗矮或纤细；++长势一般，颜色黄绿，苗过高或纤细；+++长势较好，颜色绿色；++++长势最好，颜色浓绿，苗粗壮。表七霍山石斛增值培养60d统计表60d后统计观察可得，从分蘖数来看(参照图1)，处理5最好，其次是处理2，处理4，处理3，处理9分蘖数最差。从生长值来看(参照图2)，处理5最好，其次是处理4，处理2，处理1，同样处理9最差。从生长势、颜色来看，处理4和处理5最好，颜色浓绿，苗粗壮，处理1和处理2次之，长势较好，颜色绿色，处理7和处理9最差，长势最弱。综合分析可得，处理5、处理4最适宜做霍山石斛增殖培养培养基。其中处理5最好即NAA1mg/L+6-BA1.5mg/L组合最适宜做霍山石斛增殖培养培养基。处理4未添加6-BA其分蘖性较处理5和处理2差，但苗的长势较好，而且实验发现处理4的苗无需进行生根壮苗可实现一步成苗，既节约生产资料又缩短了时间，弊端在于出苗质量稍差于进行生根壮苗的种苗，且出苗数量稍低于转接一代的生根苗。实验发现添加一定浓度的6-BA和NAA能促进霍山石斛增殖诱导，NAA浓度不变，在一定范围内，随着6-BA浓度的升高其增殖诱导效果也逐渐变强，实验可得添加6-BA1.5mg/L诱导效果最强，但浓度高于6-BA1.5mg/L时，诱导效果反而变弱，说明高浓度的6-BA能抑制霍山石斛增殖培养。但6-BA浓度不变的情况下，添加一定浓度梯度的NAA，其增殖效果也是随着NAA浓度的上升先加强后减弱，因此高浓度的NAA对霍山石斛的增殖效果无益。表八霍山石斛增值培养60d统计表通过表八可得，NAA：1.0mg/L～1.2mg/L，6-BA：1.5mg/L～1.7mg/L时，霍山石斛的生长式及颜色都最好。综合分析可得，最适宜霍山石斛增殖培养的培养基为1/2MS培养基+花宝4号1.5g/L+香蕉50g/L+碳粉0.5g/L+NAA1mg/L+6-BA1.5mg/L。M2培养基配方：1/2MS培养基，花宝4号：1.0～2.0g/L，香蕉：40g/L～60g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：1.0mg/L～1.2mg/L，6-BA：1.5mg/L～1.7mg/L。在上述步骤f中，通过正交设计，得出较佳的M4培养基配方。基本培养基为1/2MS培养基，碳粉0.2g/L～1.0g/L，并且添加不同浓度的NAA、IBA，配置9个不同激素配比的生根培养基，添加物分别选择香蕉和土豆，浓度分别为100g/L。培养基配方如表五，将高度一致，约为2.5cm的增殖苗接种于这9个不同处理的培养基中，每个处理接种20瓶，每瓶接种5棵霍山石斛增殖苗，75d统计观察一次并记录小苗生长势、健壮度、苗高、茎粗、根数、根粗。培养条件为温度约25℃，光照约2000lx10个小时。表九霍山石斛生根激素配比表各个处理培养约75d后取出试管苗，洗净，测量株高，茎粗、根数、根粗，比较分析如图3至图10。分析结果如下：香蕉处理株高(参照图7)：添加100g/L香蕉培养40d后，处理8，激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0.5mg/L株高最高为8.2cm，其次为处理1激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L株高为6.5cm，处理7最低，激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0mg/L株高仅为4.8cm。高浓度的NAA(1.5mg/L)配合一定浓度的IBA(0.5mg/L)能有效的促进霍山石斛生根苗的增高。香蕉处理茎粗(参照图8)：添加100g/L香蕉培养40d后，石斛茎粗平均达到0.34cm，其中处理8即激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0.5mg/L茎粗最大为0.39cm，其次为处理2即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L、处理5即激素配比为NAA1mg/L+IBA0.5mg/L茎粗其次为0.38cm，处理6即激素配比为NAA1mg/L+IBA1mg/L茎粗最低，仅为0.28cm。单独添加一定浓度的NAA对茎粗的生长效果不明显，而添加较高浓度的NAA(1.5mg/L)配合一定浓度的IBA(0.5mg/L)能有效的促进霍山石斛茎的横向生长，增强茎粗。香蕉处理根数、根粗(参照图9和图10)：添加100g/L香蕉培养40d后根数明显增加，各个处理根数均较多，平均根数达到8根，其中处理1即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L根数最大，为10根，而处理3即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA1mg/L、处理8即激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0.5mg/L根数均较多，平均根数达到8.5以上。因此香蕉能有效的促进霍山石斛发根。而香蕉处理其根粗平均达到1.1mm，其中处理3即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA1mg/L根粗最大为0.14cm，而处理6即激素配比NAA1mg/L+IBA1mg/L和处理1即激素配比NAA0.5mg/L+IBA0mg/L根粗其次为0.12cm。单纯加低浓度的NAA培养能有效的促进根的横向生长。添加香蕉处理的霍山石斛生根培养培养基中，综合生根苗株高、茎粗、根数、根粗这几个指标分析可得，适合霍山石斛生根壮苗的激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0.5mg/L。土豆处理株高(参照图3)：添加100g/L土豆培养40d后，处理7，激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0mg/L株高最高为6.7cm，其次为处理9激素配比为NAA1.5mg/L+IBA1mg/L株高为6.2cm，处理1激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L株高为5.8cm，处理2最低，激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L株高仅为5.34cm。高浓度的NAA(1.5mg/L)能有效的促进霍山石斛生根苗的增高。土豆处理茎粗(参照图4)：添加100g/L土豆培养40d后，各个处理石斛茎粗差异不大，均达到0.3cm以上，处理1即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L茎粗相对最大为0.4cm。处理2即激素配比为：NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L、处理4即激素配比为NAA1mg/L+IBA0mg/L培养茎粗相对较少为0.37cm，而处理5即激素配比为NAA1mg/L+IBA0.5mg/L茎粗最低为0.29cm，最大值于最小值相差仅为1mm，差异不大。因此添加土豆处理的不同激素配比对石斛茎粗的增长影响效果不大。土豆处理根数、根粗(参照图5和图6)：添加100g/L土豆培养40d后，各个处理石斛根数和根粗差异不大。根数方面处理9即激素配比为NAA1.5mg/L+IBA1mg/L根数最大为7.8，处理6即激素配比为NAA1mg/L+IBA1mg/L和处理1即激素配比为：NAA0.5mg/L+IBA0mg/L根数次之，依次为5.9和5.1。根粗方面处理1即激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L和处理8即激素配比为NAA1.5mg/L+IBA0.5mg/L根粗最大为0.14cm，处理4即激素配比为NAA1mg/L+IBA0mg/L根粗对小仅为0.08cm。添加土豆处理的霍山石斛生根培养培养基中，综合生根苗株高、茎粗、根数、根粗这几个指标分析可得，适合霍山石斛生根壮苗的激素配比为NAA0.5mg/L+IBA0mg/L。综合分析可得：添加香蕉处理霍山石斛生根苗长势普遍比添加土豆处理好，添加香蕉处理组石斛株高和根数明显比添加土豆处理好，而茎粗和根粗差异不显著，且添加香蕉处理石斛苗颜色浓绿，添加土豆处理石斛苗颜色浅绿。综合分析可得，添加香蕉100g/L更适宜霍山石斛生根培养。从表十可以看出，无论是从株高、根数还是根粗上看，香蕉浓度值为100g/L～120g/L时，石斛根系生长最好。表十霍山石斛生根激素配比表由此可得，适宜霍山石斛生根壮苗M4培养基为：1/2MS培养基，香蕉：100g/L～120g/L，碳粉0.2g/L～1.0g/L，NAA：0.5mg/L～1.5mg/L，IBA：0.5mg/L～1.0mg/L。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的
技术领域：
均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页1 2 3