本发明涉及以高比率保有异种动物的血液细胞的血液嵌合非人动物的制作。
背景技术：
以高比率保有人的血液细胞的非人动物作为评价对药剂、疾病、病毒感染等的反应的评价系统是非常有前景的，期待其成为在医学·医疗领域的发展中非常重要的模型动物。迄今为止，向超级免疫缺陷小鼠移植人的造血干细胞从而制作以高比率保有人的造血细胞的血液人源化小鼠。在血液人源化小鼠的情况中，难以进行长期试验，此外，由于存在与人的解剖学、生理学上的特征不同的部分，因此期望用与人的类似点多的猪、非人灵长类来制作以高比率保有人血液细胞的动物。然而，迄今为止，用非人灵长类、中型~大型的家畜动物还无法制作以高比率保有人血液细胞的动物。
作为人血液嵌合动物的制作方法，已知通过向免疫耐受状态的非人动物胎儿移植人造血干细胞，可以制作人血液嵌合个体（专利文献1）。其为本申请发明人等开发的技术，该方法中，即使在猪、绵羊等大动物的情况下，也能够制作保有人的血液细胞的血液嵌合个体。然而，造血干细胞的成活率低，血液的嵌合率为数个百分点以下。从出生后起造血干细胞的成活数开始减少，无法经长时间维持异种的血液细胞。
此外，还报告了将使作为参与造血的基因的hoxb4基因过表达的人造血干细胞作为供体细胞而移植至绵羊胎儿的方法（非专利文献1），但该方法中，造血干细胞的成活率也不足10%，无法长期以高比率维持血液嵌合状态。
另一方面，已知lnk（也称为sh2b3）是主要在造血系统细胞和淋巴组织中表达的细胞内衔接蛋白，对巨核细胞的增殖和成熟、造血干细胞的扩增和造血能力发挥抑制性作用。还已知下述技术：在胚胎干细胞中，通过敲除或敲低lnk基因，从而促进向巨核细胞的分化，增大血小板的生产（专利文献2）。然而，破坏了lnk基因的造血干细胞在异种动物中的成活性尚不明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-229802号公报
专利文献2：日本特开2007-089432号公报
非专利文献
非专利文献1:abetetal.exvivoexpansionofhumanhscswithsendaivirusvectorexpressinghoxb4assessedbysheepinuterotransplantation.exphematol.39(1),47-54(2011)。
技术实现要素：
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供在中型~大型的家畜动物中也能够制作经长时间维持以高比率保有源自人等异种动物的血液细胞的状态的血液嵌合动物的新型手段。
用于解决课题的手段
本申请发明人等对通过向胎儿移植造血干细胞而制作血液嵌合动物的技术的条件进行深入研究的结果发现，通过将缺失作为主要在造血系统细胞和淋巴组织中表达的细胞内衔接蛋白的sh2b3/lnk的小鼠造血干细胞作为供体细胞而移植至猪胎儿，能够显著提高小鼠造血干细胞在猪中的成活率，即使在16月龄的情况下，也能够得到维持10%以上这一高血液嵌合率的血液嵌合猪。因此发现，通过在供体细胞中改造lnk基因、作用于造血系统的其它适当基因的功能，能够大幅提高源自异种的供体造血系统细胞的成活率，能够制作经长期维持血液嵌合状态的非人动物，从而完成了本申请的发明。
即，本发明提供保有源自异种动物的血液细胞的非人动物的制造方法，其包括：将异种动物的造血系统细胞移植至非人动物，前述造血系统细胞为改造了作用于造血系统的基因的功能的细胞。此外，本发明提供保有源自异种动物的血液细胞的非人动物，其中，源自异种动物且改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞成活，在外周血中保有源自异种动物的血液细胞。进一步，本发明提供血液细胞的制造方法，其包括：从上述本发明的非人动物采集血液，并分离前述源自异种的血液细胞。
发明效果
通过本发明，能够提供长期维持高嵌合率的血液嵌合非人动物。根据本发明的方法，即使以猪等中型~大型哺乳动物作为受体的情况中，源自异种动物的造血系统细胞的成活率也急剧提高，即使在出生后16月龄的情况下，血液的嵌合率也能够维持10%以上的状态。以10%以上这一高比例稳定地保有异种动物的血液细胞的动物在非人灵长类和中型~大型的家畜哺乳动物中不存在制作例，通过本发明而能够首次提供。使用不呈现免疫缺陷症状的通常的非人动物而制作血液嵌合动物时，不需要超净间那样的特殊环境，能够在通常的饲养环境下在维持高嵌合率的同时进行饲养。以高比率保有异种动物的血液的血液嵌合动物能够用作药剂、疾病、病毒感染等的评价模型，对于药剂的筛选是有用的。此外，还研究了用猪等家畜动物制作人的移植用脏器的技术，认为以高比率保有人血液细胞的家畜动物对人细胞形成免疫耐受，因此认为，作为生产人的移植用脏器的情况也是适合的，此外还能够在人脏器的保存中有效应用。进一步，如果用大型动物制作以高比率保有人血细胞的血液嵌合动物，则能够大量生产人血液细胞，因此作为献血的替代技术也是非常有希望的。
附图说明
图1是实施例中制作的猪幼崽的45日龄时血液样品的通过流式细胞仪得到的解析结果。a为使用了抗小鼠cd45抗体的小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品的流式细胞仪的单参数直方图的一个例子。b是算出小鼠有核血细胞在血液样品中的全部有核血细胞中所占的比例的结果。c是检测小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品中的粒细胞和b细胞的双参数直方图的一个例子。d是检测小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品中的粒细胞和t细胞的双参数直方图的一个例子。
图2是用pe标记的抗小鼠cd45抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟白细胞的结果。
图3是用fitc标记的抗小鼠gr-1抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟粒细胞的结果。
图4是针对16月龄的猪幼崽的血液样品用小鼠cd45阳性细胞进行门控（gating）从而研究小鼠白细胞中的粒细胞的比例的结果。
具体实施方式
在根据本发明的血液嵌合非人动物的制造方法中，将改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞移植至非人动物。造血系统细胞是与成为受体的非人动物不同的动物的造血系统细胞，可以是造血干细胞，也可以是造血前体细胞。通常是主要包含造血干细胞的细胞群。
非人动物优选为中型~大型的哺乳动物，例如可以为中型~大型的家畜哺乳动物。作为中型~大型哺乳动物的具体例，可以举出包括猪、牛、山羊、绵羊、鹿、骆驼等偶蹄类、和马等奇蹄类的各种有蹄动物、以及猴子等，但不限定于这些。家畜动物典型而言可以为有蹄动物。在非灵长类中制作人的血液时，从与人的解剖学上的类似性等观点出发，可以特别优选地使用猪。
异种动物只要是与接受造血系统细胞的移植的非人动物不同种类的动物，则没有特别限定，典型而言为哺乳动物、最优选为人。
基因功能的改造是基因功能的抑制或促进。一般而言，在对造血系统发挥抑制性作用的基因的情况中，只要抑制该基因的功能即可，在对造血系统发挥促进性作用的基因的情况中，只要促进该基因的功能即可。
“抑制基因的功能”是指在用于移植的造血系统细胞中，通过改造基因组上的该基因区域中的至少一部分等，使原本编码的mrna或蛋白质的生成或累积降低或缺失，包括基因的功能的降低至功能的完全缺失。用于抑制特定基因的功能的基因改造方法在本领域广泛公知，只要是本领域技术人员，则能够适当选择执行。如果大致分类，有使基因的功能缺失的基因破坏法（敲除法）、和使基因的功能降低的基因敲低法。作为敲除法的具体例，可以举出通过利用靶向载体的同源重组的敲除法、锌指核酸酶（zfn）法（porteus,m.h.etal.genetargetingusingzincfingernucleases.nat.biotechnol.23,967-973(2005).）、talen法（christian,m.etal.targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornucleases.genetics186,757-761(2010).）、和crispr/cas9法（sander,j.d.etal.crispr-cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes.natbiotechnol32,347-355(2014).）等。作为敲低法的具体例，可以举出反义法、rnai等。如果以高效率进行敲低，则能够得到与敲除等同的结果。此外，还可以通过导入显性失活突变来抑制基因的功能。
“促进基因的功能”是指在用于移植的造血系统细胞中，使该基因的mrna或蛋白质的生成量或累积量增大。基因的功能的促进可以通过使该基因过表达等而实现。
改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞可以由像这样改造了基因功能的动物的骨髓细胞、脐带血而得到。此外，可以从不具有这样的遗传性改造的动物的骨髓细胞、脐带血中回收造血系统细胞、并对这些细胞进行期望的基因功能的改造。或者除此之外，在胚胎干细胞（es细胞）、人工多能性干细胞（ips细胞）等具有分化多能性的细胞（以下称为多能性细胞）中，进行期望的基因功能的改造，其后使其分化诱导为造血系统细胞，由此可以制备改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞。从多能性细胞分化诱导造血干细胞的情况中，所得细胞群中除了造血干细胞之外还可以包括造血前体细胞。可以将这样的细胞群作为造血系统细胞用于移植至非人动物。
作为从多能性细胞分化诱导造血系统细胞时能够使用的多能性细胞的具体例，除了上述胚胎干细胞（es细胞）、人工多能性细胞（ips细胞）之外，可以举出胚胎肿瘤细胞（ec细胞）、胚胎生殖细胞（eg细胞）、多能性生殖细胞（mgs细胞）等。
作为作用于造血系统的基因的优选具体例，首先可以举出lnk基因（也称为sh2b3基因）。已知lnk对巨核细胞的增殖和成熟、造血干细胞的扩增和造血能力发挥抑制性作用。因此，在lnk基因的情况中，只要制备lnk基因的功能受到抑制的造血系统细胞即可。
例如，lnk基因的功能受到抑制的人造血系统细胞可以通过下述方式制备：在人的多能性细胞株中，进行抑制lnk基因的功能的遗传性改造，将所得lnk基因抑制株分化诱导为造血系统细胞。此时，从能够在不破坏人胚胎的情况下制作的这一伦理性观点出发，可以优选使用人ips细胞。ips细胞如在本领域中公知的那样，是通过向动物个体的体细胞中导入细胞初始化因子而制备的具有es细胞样的分化多能性的细胞。从体细胞制备ips细胞的方法是公知的。
lnk基因在包括人在内的各种动物中鉴定而公知。人的lnk基因存在于第12号染色体上（12q24,annotationrelease107,grch38.p2(gcf_000001405.28),nc_000012.12(111405108..111451624)），序列等信息在ncbi的数据库中以geneid:10019、accessionno.nm_005475登记。序列表的seqidno.1和2所示的序列是以nm_005475登记的人lnk基因的cdna序列和其编码的氨基酸序列。人lnk蛋白质具有aa1-193的二聚体形成结构域、aa206-307的普列克底物蛋白同源（pleckstrinhomology;ph）结构域、和aa364-462的src同源（srchomology2;sh2）结构域。
作为在人的多能性细胞株中抑制lnk基因的功能的方法，可以举出lnk基因的敲除、对lnk基因利用sirna的rnai、导入显性失活突变等。
lnk基因的敲除可以通过例如下述方式实施：在多能性细胞的基因组的两个等位基因中，使lnk基因的编码区域、启动子区域缺失，或者以无法产生正常的lnk蛋白质的方式插入终止密码子或者导入氨基酸的取代·插入等突变。使编码区域缺失时，可以使编码区域全部缺失，也可以使其部分缺失。下述实施例中使用的lnk纯合ko小鼠是在lnk基因的编码区域之中缺失外显子2~7的小鼠，认为在人细胞中，也可以通过使这些区域缺失从而敲除lnk基因。为了方便筛选敲除细胞株，可以将lnk基因编码区域中的全部或一部分替换为耐药性、荧光蛋白质等的标记基因序列。
在使用靶向载体的敲除法中，通过pcr从异种动物的基因组dna扩增要使其缺失的区域的上游侧和下游侧的基因组序列，制备上游侧同源区和下游侧同源区，将这些同源区和标记基因依次插入适当的质粒载体中，构建包含以上游侧同源区-标记基因-下游侧同源区的顺序排列的基因破坏用dna构建体的靶向载体，将其通过电穿孔等常规方法导入异种动物的多能性细胞中即可。将这样的靶向载体导入细胞时，通过同源重组而在基因组上的期望位置处导入基因破坏用构建体，生成将lnk基因中的一部分或全部替代为标记基因而得到的突变等位基因。
上游侧同源区和下游侧同源区的尺寸对同源重组的效率造成影响，在效率低的生物种类中，使用尺寸大的同源区。在哺乳动物的基因破坏中，常规使用的同源区为数kb左右的尺寸。一般而言是一个同源区设为1~3kb左右（短臂）、另一个同源区设为5kb左右以上（长臂），但也可以是两者均设为5kb左右的尺寸。在以人为首的各种的动物中，鉴定全基因组序列信息（bac序列、鸟枪法序列等），在数据库中登记，因此可以从这样的数据库获取对于制备同源区必要的序列信息。
在哺乳动物细胞中，通过同源重组而将基因破坏用构建体导入基因组中的频率与不通过同源重组而随机导入的频率相比非常低。因此，在人等哺乳动物的多能性细胞中敲除lnk基因时，优选组合使用赋予耐药性的阳性选择标记和赋予药剂敏感性的阴性选择标记。在上述基因破坏用构建体中，将2个同源区之间连接的标记基因设为阳性选择标记基因，并在2个同源区的外侧（上游侧同源区的5'侧或下游侧同源区的3'侧）连接阴性选择标记基因即可。如果将该构建体通过同源重组导入基因组中，则构建体之中同源区的外侧的区域未导入基因组中，因此不通过阴性选择标记基因而赋予药剂敏感性。另一方面，在不通过同源重组将该构建体导入基因组中时，阴性选择标记基因也被导入基因组中，因此，对这样的转化细胞赋予药剂敏感性。因此，将基因破坏用构建体导入多能性细胞中后，进行利用阳性选择标记和阴性选择标记的筛选，则能够高效率地选择通过同源重组而在适当的位置导入构建体且lnk基因被破坏的多能性细胞。
如果举出常规使用的标记基因的具体例，作为阳性选择标记，可以举出新霉素耐性基因、杀稻瘟素耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等，作为阴性选择标记，可以举出胸苷激酶基因、白喉毒素a片段（dt-a)等，但不限定于这些。将它们分别与适当的启动子组合使用，但只要是本领域技术人员，则能够根据标记基因的种类而适当选择。
利用标记筛选之后，利用pcr、dna印迹法进行基因破坏的确认，获取具有lnk基因被破坏的等位基因的细胞。用于pcr的引物、用于dna印迹法的探针可由本领域技术人员根据基因破坏用dna构建体的结构而适当设计。
如上所述，由于哺乳动物细胞中的同源重组的频率非常低，因此在两个等位基因处同时发生同源重组的可能性极低，通常形成杂合的敲除。为了得到以纯合敲除的细胞，使用确认为杂合敲除（heteroknockout）的细胞株，再次重复上述基因破坏用构建体的导入和筛选即可。在制备杂合敲除细胞中使用的基因破坏用dna构建体和制备纯合敲除细胞中使用的基因破坏用dna构建体中，如果使用不同的耐药性阳性选择标记，则能够适当选择纯合敲除（homoknockout）细胞。
为了提高同源重组的效率，除了lnk基因敲除处理之外，还可以进行bml基因的敲低处理。在使用人细胞的研究中，据报告，bml基因的敲低处理提高同源重组效率（sosetal.genestocells2006;11(4):363-371.），认为在人和除了人之外的动物中，同样地bml基因的敲低对同源重组效率的增加也有效。bml基因的序列信息等也是公知的，用于敲低各种动物种类的bml基因的核酸试剂是市售的，因此，只要是本领域技术人员，则能够使用适当的这样的市售品来实施bml基因的敲低处理。
利用rnai的目标基因的敲低方法也是公知且确立的技术。为了得到通过rnai恒定地敲低lnk基因的细胞株，使用质粒载体、病毒载体等表达载体而在细胞内生产sirna即可。一般而言，使用制备表达发夹型rna（shrna）的载体、并将该载体导入细胞中在细胞内使rnai生成的方法。细胞内表达的shrna被细胞内的dicer酶识别·剪切从而生成sirna。针对lnk基因的sirna、shrna也可以基于lnk基因的序列信息而设计。用于在细胞内生产sirna的表达载体的各种类是公知的。此外，还大量存在提供设计sirna·shrna、制作rnai用表达载体、制备基于rnai的敲低细胞株等委托服务的服务商，因此也可以利用这样的服务商。
作为记载人多能性细胞中lnk基因的敲除和敲低的实例的文献，可以举出felixc.giani,etal.,"targetedapplicationofhumangeneticvariationcanimproveredbloodcellproductionfromstemcells",cellstemcell18,73-78,january7,2016。giani等人以lnk基因的外显子3内的区域（sh结构域内的区域）作为对象，进行了利用crispr/cas9法的敲除、和利用rnai的敲低。具体而言，在利用crispr/cas9法的敲除中，将编码第261号精氨酸的cgg用作pam（前间区序列邻近基序（protospaceradjacentmotif）），以紧接其之前的20个碱基（seqidno.1的1118~1137位的区域）作为标的而设计指导rna，在外显子3内（sh结构域内）诱发dna双链切断，通过发生移码而进行lnk基因的敲除。如果使敲除了lnk的人多能性细胞分化为造血系统细胞，则还确认到红细胞的产生大幅上升。在利用rnai的敲低中，也以外显子3内的区域（sh结构域内的区域）作为标的而设计shrna。将giani等人使用的shrna构建体的序列示于seqidno.3和4中。通过慢病毒载体而在造血干·前体细胞内表达shrna，敲低lnk时，确认到促进红细胞分化。giani等人进行的方法可以优选地在本发明中制备敲除或敲低了lnk基因的人造血系统细胞的情况中采用。
此外，在giani等人的上述文献中，作为能够使lnk的功能缺失或者大幅损伤的天然的错义突变，记载了e208q、s213r、i257r、e301k、s370c、s394g、e395k、e400k、r425c、i446v、r518*。通过在lnk的两个等位基因处导入这些突变，也能够抑制lnk基因的功能。
lnk的显性失活突变也是已知的。例如，日本特开2007-89432号公报中记载了小鼠lnk的显性失活突变体，认为在人lnk中也可以同样地用作显性失活突变体。作为lnk的显性失活突变体的具体例，可以举出sh2结构域的突变（例如第364号精氨酸取代突变为谷氨酸）、ph结构域的缺失突变、c末端结构域的缺失突变、和这些突变的组合。应予说明，在seqidno.2所示的人lnk的氨基酸序列中，ph结构域是第194号~第309号氨基酸，sh2结构域是第355号~第451号氨基酸，c末端结构域是包含酪氨酸磷酸化区域的第452号~第575号氨基酸，小鼠中公知的显性失活的c末端缺失突变的区域在人的lnk中相当于第526号~第575号氨基酸的区域。通过将这样的显性失活突变体导入多能性细胞，能够抑制基因组上的lnk基因的功能。显性失活突变体向细胞的导入可以例如使用病毒载体等来实施。
以上，以lnk基因作为主要例子针对敲除和敲低操作进行说明，但对于作用于造血系统的其它基因，也可以以同样的方式实施敲除和敲低。
应予说明，通过敲除·敲低等基因改造操作，有时在造血系统细胞的基因组上导入标记基因，在这样的情况中，从该造血系统细胞分化的血液细胞之中的有核血细胞的基因组上也存在标记基因。在不期望存在标记基因的情况中，使用不在基因组上残留标记基因的基因改造方法（例如利用talen、crispr/cas9的方法、利用rnai的敲低等）来进行lnk基因等作用于造血系统的基因的功能改造即可。或者，还可以通过利用loxp/cre重组系统，除去基因组中的标记基因。例如，通过移植敲除了lnk的造血系统细胞而使人的血液在非人动物中生产时，使用预先在标记基因的3’末端和5’末端的位置插入loxp序列而得到的标记基因来构建敲除载体，制作人的多能性细胞的lnk敲除株。对该lnk敲除株、或者从该株分化诱导得到的lnk敲除造血系统细胞，通过感染表达cre重组酶的腺病毒等处理，可以将被loxp序列夹持的标记基因区域从lnk敲除细胞的基因组中除去。
作为从多能性细胞分化诱导造血系统细胞的方法，已知例如借助畸胎瘤（テラトーマ）形成的分化诱导方法（wo2011/071085）。
在该方法中，将多能性细胞移植于非人哺乳动物的皮下、睾丸、骨髓等，从而在该非人哺乳动物体内形成畸胎瘤。为了提高分化诱导的效率，也可以与多能性细胞一起移植共培养细胞。作为共培养细胞，可以举出饲养细胞、基质细胞，例如可以优选使用op-9细胞。向小鼠移植人ips细胞时，移植约1~10×106个的ips细胞和其1/10~1/2左右的量的共培养细胞即可。
向移植后的非人哺乳动物施用干细胞因子（scf）、血小板生成素（tpo）等分化诱导剂。分化诱导剂通常使用浸透泵等而在皮下连续施用。
饲养该动物适当的期间，至在移植后的非人哺乳动物中形成足够尺寸的畸胎瘤为止。通常，在移植后4~12周左右形成足够尺寸的畸胎瘤。可以从该畸胎瘤中分离造血干细胞等造血系统细胞。此外，分化的造血系统细胞从畸胎瘤移动从而在骨髓中也成活，因此还能够从骨髓中回收目标造血系统细胞。例如，从畸胎瘤组织、骨髓细胞分离回收人的造血干细胞时，可以通过使用人造血干细胞的表面抗原即抗人cd34抗体、抗人cd117抗体、抗人133抗体等的磁性细胞分离法或细胞分选法从而特异性地选择并回收人造血干细胞。但是，上述造血系统细胞的分离回收方法是一个例子，也可以使用除此之外的任意方法。
以上述那样的方式，例如在小鼠等实验动物的体内从人ips细胞分化诱导造血干细胞等造血系统细胞，能够得到本发明中使用的移植用的造血系统细胞群。但是，上述借助畸胎瘤形成的分化诱导法是从多能性细胞分化诱导造血系统细胞的方法的一个例子，可以使用除此之外的任意方法。
造血系统细胞的移植可以对非人动物的胎儿进行，此外，也可以对出生后的非人动物个体进行。移植于出生后的个体时，利用常规的骨髓移植法即可，使用呈现免疫缺陷症状的非人动物个体时，可以省略免疫抑制剂的施用。向胎儿移植细胞可以通过经子宫移植来进行。经子宫移植可以对母体开腹而进行，也可以不开腹而经皮进行。这样的经子宫移植法是公知的，例如日本特开2005-229802号公报等中记载了具体的流程。
在经子宫移植法中，将妊娠的非人动物全身麻醉，对皮肤进行剃毛并充分清洗·消毒，通过超声断层装置从皮肤之上或子宫表面观察子宫内的胎儿的同时，移植造血系统细胞。细胞移植通过注射针或穿刺针来进行。所使用的针的粗细度根据非人动物的种类而异，在中型~大型的哺乳动物的情况中，通常为22~27号（gauge）左右。
移植时的胎儿的日龄在向免疫系统的功能缺陷的非人动物胎儿移植的情况中没有特别限定。在使用未示出免疫缺陷症状的常规的非人动物的情况中，需要对处于免疫耐受状态的时期的胎儿进行移植。在猪的情况中，如果超过约50日龄则免疫耐受开始丧失，因此优选对60日龄左右以下、例如20~60日龄、20~55日龄、30日龄~55日龄、30~52日龄、或30~50日龄的胎儿进行移植。在此，胎儿的日龄是指以受精日或交配日作为0日龄从而表示的胎龄。应予说明，在猪的情况中，也已知呈现免疫缺陷症状的系统（例如日本特开2015-002719号公报等），向这样的免疫缺陷猪的胎儿移植时，在胎龄更高的胎儿中也能够移植。
移植造血系统细胞的部位没有特别限定。一般而言，通过向胎儿的心脏移植，能够实现供体细胞的高成活率。近年来，由于超声图像诊断装置的性能的提高，即使在数十日龄以下的胎儿的情况中，也能够确认心脏的位置从而移植细胞。但是，也可以向肝脏等其它脏器、腹腔内等其它部位移植。细胞移植后，根据需要向胎儿的腹腔内、羊水腔内注入抗生素。对于移植操作后的母体，为了预防感染症，也优选施用抗生素。
在猪等多胎妊娠动物的情况中，通常仅向子宫内的胎儿中的一部分（例如2~5只左右）进行细胞移植。为了能够简便地在出生时区分移植崽和非移植崽，也可以在受体胎儿的腹腔内等适当的部位插入金属制的短线等作为能够通过x射线识别的标记。
使移植了细胞的胎儿在母体内发育，通过自然分娩或剖腹产而出生，能够得到保有源自异种动物的血液细胞的血液嵌合的非人动物个体。该非人动物的血液的嵌合率为10%以上，可以为例如11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、或15%以上。根据本发明的方法，还能够制作血液的嵌合率为20%以上的非人动物个体。通过本发明的方法得到的血液嵌合动物可以经长期维持如上所述高的血液的嵌合率。例如，本发明的血液嵌合动物在造血系统细胞的移植后3个月、6个月、10个月、或12个月的时点时，或者在向非人动物的胎儿移植造血系统细胞而制作的血液嵌合动物的情况中在3月龄、6月龄、10月龄、或12月龄的时点时，维持如上所述高的嵌合率。
本发明中，“血液的嵌合率”是指外周血中存在的血液细胞之中源自异种动物的血液细胞所占的比例。血液细胞中包括红细胞、白细胞和血小板。白细胞中包括粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）、淋巴细胞、单核细胞。有核血细胞中包括白细胞、成红血细胞、巨核细胞、造血干细胞、造血前体细胞。外周血中存在的有核血细胞主要为白细胞，成红血细胞、巨核细胞、造血干细胞和造血前体细胞在外周血中也存在，但其量为极少量。因此，本发明中的“血液的嵌合率”这一术语包括白细胞（有核血细胞）的嵌合率、红细胞的嵌合率、和血小板的嵌合率。
血液的嵌合率可以通过末梢血的流式细胞仪解析而容易地调查。作为典型的表面标记的具体例，在白细胞的情况中可以举出cd45，在红细胞的情况中可以举出ter-119，在血小板的情况中可以举出cd41，在粒细胞的情况中可以举出gr-1。使用针对这些的标记抗体进行末梢血样品的流式细胞仪解析即可。
以高比率保有异种动物的血液的血液嵌合动物能够用作药剂、疾病、病毒感染等的评价模型，对于药剂的筛选是有用的。此外，还研究了用猪等家畜动物制作人的移植用脏器的技术，如果是以高比率保有人的血液的猪，则对于人的移植用脏器的生产也是适合的。
进一步，除此之外，如果用大型动物制作以高比率保有人血细胞的血液嵌合动物，则能够大量生产人血液细胞，因此作为献血的替代技术是有希望的。血液嵌合动物的血液中还包含原本的该动物的血液细胞，但通过例如从该动物回收血液、并使用针对对于目标的异种来源血液细胞特异性的表面抗原的抗体（例如，回收猪中所制作的人红细胞时，为对人ter-119的抗体）进行分选，能够分离回收目标的异种来源血液细胞。想要进一步提高源自异种动物的红细胞、血小板的保有量时，例如对血液嵌合动物施用促红细胞生成素、血小板生成素等细胞因子，促进从骨髓中成活的源自异种动物的造血干细胞产生红细胞、血小板即可。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明不限定于下述实施例。
1．敲除了lnk基因的小鼠造血干细胞的制备
lnk纯合敲除小鼠使用东京大学医科学研究所动物实验设施中在无病原体的特殊条件下维持的公知的小鼠品系（takakietal.,2000.controlofbcellproductionbytheadaptorproteinlnk.definitionofaconservedfamilyofsignal-modulatingproteins.immunity.13:599-609.;日本特开2007-89432号公报）。该小鼠品系是从通过靶向载体破坏了lnk基因的编码区域的小鼠es细胞制作lnk杂合敲除小鼠、并使该杂合敲除小鼠交配而制作的品系。
对于提供向猪胎儿移植的造血干细胞，其通过从lnk纯合敲除小鼠采集骨髓、利用比重离心法分离有核细胞、进行磁性细胞分离或细胞分选，作为造血干细胞得到浓缩的细胞群而得到。
2．向猪胎儿的造血干细胞移植
按照日本特开2005-229802号公报中记载的方法，在超声引导下，向猪胎儿的肝脏内经子宫移植源自lnk纯合ko小鼠的造血干细胞。通过人工授精而怀孕的杜洛克种类和大约克夏种类的杂交种类的猪胎儿（交配日为2013年4月1日、经子宫移植日为2013年5月10日、胎龄为39日）用于造血干细胞移植。猪的繁殖和饲养管理在spf环境下进行。
(1)麻醉
移植当日，对妊娠猪通过肌肉注射咪达唑仑、美托咪定、硫酸阿托品进行预麻醉，其后通过面罩进行吸入麻醉。吸入麻醉中，使用笑气、氧气、异氟烷。
(2)消毒和开腹
对妊娠猪进行麻醉导入后，对腹部剃毛并充分地用聚维酮碘（povidone-iodine）制剂清洗腹部后，用聚乙烯吡咯酮碘（isodine）充分消毒。对母体开腹，露出子宫。
(3)通过超声描绘猪胎儿
猪胎儿的识别和细胞的注入中使用超声断层装置aloka超声诊断设备ssd-500（alokaco.,ltd.tokyo,japan），越过子宫进行移植。超声探头使用7.5mhz电子线阵探头（aloka;ust-5820-5）。
(4)穿刺针
用于向胎儿导入造血干细胞的穿刺针使用25号的注射针（nipro,osaka,japan）。通过超声图像确认脏器的位置，向胎儿的肝脏注入lnk纯合ko小鼠的造血干细胞。向胎内的猪胎儿之中的一部分（5只）进行细胞移植。
(5)细胞的注入
每1只受体胎儿通过穿刺针注入混悬于0.2ml的磷酸缓冲生理盐水中的造血干细胞3.47×106个。其后，向胎儿腹腔内注入抗生素0.2ml，拔出穿刺针，关腹。
(6)术后的抗生素的施用
妊娠猪在其后经2天通过肌肉注射施用抗生素。
(7)分娩
分娩为在2013年7月25日通过自然分娩进行。
3．出生崽的解析
(1)方法
幼崽在约1周龄、约45日龄、约16月龄进行末梢血的采血，通过流式细胞仪解析调查血液细胞的嵌合率。作为阴性对照，使用野生型猪末梢血，作为阳性对照，使用野生型c57bl/6小鼠末梢血。此外，将受体幼崽与同胎的非移植幼崽作为同胎对照。
在有核血细胞的解析中，使用除去了红细胞的试样。向所采集的血液试样中添加溶血液从而除去红细胞，用添加了胎牛血清的磷酸缓冲生理盐水洗涤后，混合抗小鼠抗体。在遮光、冷藏条件下使抗体反应后，使加入添加了胎牛血清的磷酸缓冲生理盐水洗涤而制备的物质用于流式细胞仪解析。
在45日龄，分别通过fitc标记的抗小鼠cd45抗体检测小鼠的成熟白细胞（所有的有核血细胞），通过pe标记的抗小鼠gr-1mac1抗体检测小鼠的成熟粒细胞，通过apc标记的小鼠cd3e抗体检测小鼠的t细胞，通过apc-cy7标记的小鼠b220抗体检测小鼠的b细胞。
在16月龄，分别通过pe标记的抗小鼠cd45抗体检测小鼠的成熟白细胞（所有的有核血细胞），通过fitc标记的抗小鼠gr-1抗体检测小鼠的成熟粒细胞。此外，用小鼠cd45阳性细胞进行门控来解析小鼠gr-1阳性细胞数，调查小鼠白细胞中的小鼠粒细胞的比例。
(2)结果
在接受细胞移植的5只胎儿之中，1只在出生后10日龄左右死亡，因此45日龄以后的解析仅针对剩余4只进行。
图1是所得猪幼崽的45日龄时针对有核血细胞解析血液样品的结果。个体id30048、30050、30051、30052为经细胞移植的猪幼崽，个体id30053为同胎的非移植幼崽。如图1b所示，生存的4只受体幼崽均为保有小鼠有核血细胞作为有核血细胞的一部分的血液嵌合体。4只之中的3只（30048,30050,30052）示出超过15%的嵌合率。作为分化倾向，几乎为粒细胞系统，未检测到t细胞和b细胞。
图2~图4是所得猪幼崽的16月龄时的血液样品的解析结果。在16月龄的情况中，也确认到维持了高嵌合率。以下，说明各解析结果。
图2是用抗小鼠cd45抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟白细胞的结果。表面抗原cd45在所有的有核血细胞上表达，末梢血（外周血）中的有核血细胞主要为白细胞。30050、30051、30052这3只中，外周血中的全部有核血细胞之中的10%以上为小鼠血细胞，维持了高嵌合率。嵌合率最高的个体保有全部有核血细胞之中高达20%的小鼠有核血细胞。
图3是用抗小鼠gr-1抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟粒细胞的结果。在确认到高嵌合率的3只中，外周血中的粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）的数个%左右为小鼠的粒细胞。应予说明，据信，在通常的野生型猪中，各粒细胞在血液细胞中所占的比例是中性粒细胞为4.4~62.1%、嗜酸性粒细胞为0~11%、嗜碱性粒细胞为0~3.6%。
图4是用小鼠cd45阳性细胞进行门控从而调查小鼠白细胞中的粒细胞的比例的结果。在确认到高嵌合率的3只中，小鼠有核血细胞之中的约25~33%为粒细胞。
30048的个体在16月龄的时点血液的嵌合率显著降低，认为所移植的小鼠造血干细胞暂时在骨髓中成活，但没有稳定成活。
此外，在30051的个体中，45日龄时的嵌合率非常低，但16月龄时有核血细胞的嵌合率大幅上升。已知外周血中存在的血细胞之中的造血干细胞的比例非常低。在该个体中，45日龄时，小鼠造血干细胞在骨髓中成活，但从其分化的血细胞少，因此认为有可能没有反映在末梢血中的有核血细胞的嵌合率中。
以上示出了：通过将敲除了lnk的小鼠造血干细胞移植至猪，能够制作以高比例稳定地保有小鼠的血液细胞的猪。与小鼠-猪之间相比，在人-猪之间、人-非人灵长类之间的遗传性背景更接近，解剖学·生理学上的特征的类似点更多。因此认为，如果将抑制了lnk基因的功能的人造血系统细胞移植至猪、非人灵长类，则能够以与小鼠造血系统细胞等同或其以上的程度实现高成活率。
序列表
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associations
theuniversityoftokyo
<120>血液嵌合动物的制作方法
<130>pf568-pct
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<211>5425
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<213>智人（homosapiens）
<220>
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