一种制备种系嵌合动物的方法

专利名称：一种制备种系嵌合动物的方法
专利说明一种制备种系嵌合动物的方法 本发明涉及一种制备嵌合动物的方法，其中的生殖细胞通过使用遗传上不能形成生殖细胞和全能细胞的早期胚胎(通常的，一个胚泡)而形成，本发明还涉及一种通过该方法获得的嵌合动物个体，其中生殖细胞衍生自全能细胞。此处所用的全能细胞是能够分化为生殖细胞的多能细胞。此外，本发明涉及获自嵌合动物的一种杂合动物和一种纯合动物。随着发育工程技术的发展，胚胎干细胞(ES细胞)返还入胚胎引起个体发生的技术(Evans MJ & Kaufman MK，Nature 292，154-156(1981))和ES细胞中同源重组技术(Zijlstra M等人，Nature342，435-438(1989)；Thompson S等人，Cell 56，313-321(1989))已经被建立起来。这些技术通过使用小鼠而得以第一次结合，从而建立起制备改变基因的小鼠技术，如敲除(knockout)小鼠。如此全部的技术使通过哺乳动物进行突变体的制备以及之后进行基因功能研究成为可能，这本来只能通过使用酵母或果蝇完成。在后基因组时代，其作为基因功能分析所必须的重要技术，吸引着人们的注意。
关于有效地制备基因被改变了的动物，如敲除小鼠，主要有三点。第一点涉及优良的ES细胞的构建。第二点涉及ES细胞中有效的基因改变。第三点涉及基因被改变的ES细胞形成嵌合小鼠并且在所获得的嵌合小鼠ES细胞中实施的基因改变被传递给生殖细胞从而得以传给下一代。
在迄今被发展的技术中，第一点，构建优良ES细胞，主要取决于小鼠品系。除了构建概率低外，当重复传代培养时，被成功构建的ES细胞会丢失它们的被转移到种系的能力，所以，而建立起来的ES细胞通常在没有被尽可能多的重复传代培养下使用。当使用近亲交配小鼠的ES细胞时，这种倾向尤其重要。
关于第二点，同源重组技术和相关技术被不断得到改进，并且在实际应用阶段，这些技术在不断地被加以利用。
第三点涉及很多问题。尤其是，很多研究者都有痛苦的经历，如获知嵌合小鼠能够被制备，但是它们并不显示种系传递。在敲除小鼠制备中，第三点代表了一种主要障碍。因此，目前使用的实际方法涉及获得和使用被证实转移到种系且以尽可能少的量传代培养的ES细胞。
同时，ES细胞被认为在所有构成孕体的细胞谱系中具有获得正常发育的能力，但是与个体发生过程中被注射ES细胞的胚胎(通常，一个胚泡)相比，其作用于体腔外(exocelomic)的细胞谱系如胎盘的细胞谱系的能力较低(Beddington R S & Robertson E J，Development 105，733-737(1989)；Nagy A等人，Development 110，815-821(1990))。因此，一项旨在获得所有组织包括生殖组织在内衍生自ES细胞的小鼠的技术涉及将ES细胞同发育和分化方向主要偏向体腔外(exocelomic)胎盘的胚胎结合，从而引导ES细胞朝着胚胎的方向发育和分化。在这种情况下，小鼠ES细胞和小鼠四倍体胚胎的结合被认为是最适当的结合。明确地讲，单个四倍体胚胎很少在胚胎移植后独自发育，几乎没有胚胎达到第二个三月期(Kaufman MH& Webb S，Development 110，1121-1132(1990))。有报道认为，在嵌合体产生自四倍体胚胎和正常胚胎(二倍体)情况下，四倍体细胞几乎从不对胚胎自身有所贡献。但是，它在很大程度上有助于体腔外(exocelomic)膜组织(Tarkowski A K，J.Embryol.Exp.Morph.41，47-64(1977))。因此，一个被建议的方法涉及将小鼠ES细胞和小鼠四倍体胚胎结合，从而使他们彼此补充以产生联合嵌合体。这种情况下，据报导可以产生极性嵌合体，其中胎儿衍生自ES细胞。但是，大部分体腔外(exocelomic)组织衍生自四倍体细胞(Nagy A等人，Development 110，815-821(1990))。然而，通过该技术从近亲交配小鼠的ES细胞成功获得嵌合个体的例子极其少见。甚至在成功获得那些嵌合个体的情况下，由于发育失调比如呼吸紊乱或畸形，嵌合小鼠也不能够长时间存活(Eggan K等人，PNAS 98，6209-6214(2001))。因此，使用这种方法作为产生种系嵌合体的实用方法是困难的。
因此，迫切渴望发展能够产生基因被改变的嵌合个体，并有效地产生下一代个体的技术，并且在如此获得的嵌合个体中，来自ES细胞的基因改变能够被转移到生殖系。考虑到上述情况，我们集中研究了种系嵌合体的制备方法。具体地讲，要完成的目标或者说本发明的目的在于使用全能细胞，例如基因改变的ES细胞，有效地制备基因被改变的动物，例如敲除小鼠，尤其是，构建一种有效制备种系嵌合小鼠的方法。明确地说，在基因被改变的小鼠的制备中，例如敲除小鼠，研究人员遇到的一个问题是使用基因被改变的ES细胞能够产生嵌合小鼠，而基因被改变的ES细胞不能够被遗传到所获得的嵌合小鼠的生殖系，以至于基因改变不能够被转移到下一代。因此，人们渴望得到在其后代中能够获得基因改变的嵌合小鼠，并且这一问题必须得到解决。本发明解决了那些被改变的基因无法遗传至下一代的问题。
因此，我们构思出使用不能形成生殖细胞和全能细胞的早期胚胎来制备一种衍生自全能细胞的种系嵌合动物的方法。从而，我们完成了本发明。用于此处的全能细胞的例子包括能够分化为生殖细胞的多能细胞，明确地，干细胞，例如ES细胞和EG细胞，原始生殖细胞，内细胞团，以及重建胚胎，例如核移值胚胎。
本发明的目的是提供一种通过将全能细胞例如ES细胞导入不能形成生殖细胞的早期胚胎从而制备衍生自全能细胞的种系嵌合动物的方法，以及提供一种动物，其中对ES细胞或类似细胞实施的基因改变被遗传至下一代。
因此，我们研究了一种使用全能细胞例如ES细胞(胚胎干细胞)有效制备种系嵌合小鼠的方法以完成上面所述目的的方法。
本发明中的种系嵌合体意味着嵌合动物的生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。一般的，使用ES细胞制备的种系嵌合小鼠是否就是种系嵌合小鼠在下列步骤之前还不能确定在产生ES细胞的品系和具有不同毛色的品系之间产生嵌合小鼠；通过将得到的嵌合小鼠与产生ES细胞的品系杂交，或者与具有不同毛色的小鼠种系杂交，获得幼崽以确定产生ES细胞的品系的毛色。尤其是在雄性动物的情况下，即使生殖细胞形成自ES细胞，当ES细胞对生殖细胞的贡献率低的时候，要获得具有ES细胞基因的幼崽是困难的。此外，当衍生自ES细胞的精子细胞数量低或精子活力低时，不能完成受精，则不能获得幼崽。此外，当基因改变是对线粒体实施的，由于线粒体衍生自卵母细胞，雌性ES细胞一定被用于产生雌性种系嵌合小鼠。
如果能够获得在睾丸或者卵巢内仅仅具有衍生自ES细胞的生殖细胞的嵌合小鼠，幼崽肯定能够具有衍生自ES细胞的染色体，所以种系嵌合小鼠就能够被有效地产生。即使当雄性嵌合小鼠被获得，而获得的嵌合小鼠的精子细胞数量低，或者精子活力低，通过例如胞质内精子注射(ICSI)的技术，幼崽也能够容易的被获得。
在雌性嵌合小鼠的情况下，幼崽能够通过自然交配、人工授精，体外受精，或者胞质内精子注射获得。
本发明在上述研究基础上完成，并且涉及制备种系嵌合动物的方法。此外，本发明涉及通过这一方法获得的嵌合动物以及从该嵌合动物获得的基因被改变的动物。明确的说，本发明包括一种使用遗传上不能形成生殖细胞和全能细胞的早期胚胎(通常的，一个胚泡)制备嵌合动物的方法，其中生殖细胞衍生自全能细胞，以及包括一种通过该方法获得的种系嵌合动物。在本发明中，通过使用遗传因子来产生遗传上不能形成生殖细胞的早期胚胎，从而使种间F1代杂种缺少生殖细胞。在这些细胞中(也就是，雌性生殖细胞或雄性生殖细胞)，其生殖细胞缺陷发育的不同取决于动物种类。例如，在小鼠中，雄性生殖细胞将是缺陷的。明确的说，通过C57BL/6实验小鼠和与C57BL/6异源的Mus spretus彼此杂交或体外受精获得的杂合体胚胎会导致雄性不育(Matsuda Y等人，PNAS 88，4850-4854(1991))。此外，c-kit突变小鼠的胚胎，例如，通过Wv/+老鼠和W/+老鼠(Wv/W或W/Wv)彼此杂交或者体外受精获得的胚胎不能形成雄性和雌性生殖细胞(不育的/不育性)。因此，通过这些遗传因子的使用，能够产生缺少雌性或雄性生殖细胞的小鼠(Kussell ES，AdvGenet 20，357-459(1979))。尤其是，当使用Wv/W或W/Wv胚胎时，雌性种系嵌合体能够通过雌性ES细胞产生。此外，它们能够作为核移植胚胎或转基因胚胎而得以产生。
由于所有通过本发明产生的嵌合动物生殖细胞衍生自ES细胞，对雄性嵌合动物进行杂交、人工授精、体外受精，或胞质内精子注射，所以能够获得具有ES细胞的一对染色体中的一条的雄性和雌性杂合体。通过将如此获得的雄性或雌性杂合体杂交，能够容易地获得纯合体。
此外，具有ES细胞的一对染色体中的一条的雄性和雌性杂合体能够通过使用雌性嵌合动物进行杂交、人工授精，体外受精或胞质内精子注射而获得，其中雌性嵌合动物产生自受到雌性基因改变影响的ES细胞。本发明提供下面描述的方法和通过那种方法产生的嵌合动物。
(1)一种制备种系嵌合动物的方法，其中生殖细胞衍生自全能细胞，在该方法中使用不能形成生殖细胞和全能细胞的早期胚胎。
(2)上述(1)中的制备方法，其中不能形成生殖细胞的早期胚胎是胚胎、核移植胚胎或通过种间杂交获得的转基因胚胎。
(3)上述(1)或(2)的制备方法，其中全能细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖细胞(EG细胞)。
(4)上述(1)或(2)的制备方法，其中全能细胞是核移植胚胎或胚胎干细胞(ES细胞)或衍生自核移植胚胎的胚胎生殖细胞(EG细胞)。
(5)上述(1)到(4)任一制备方法，其中动物是小鼠。
(6)上述(5)的制备方法，其中不能形成生殖细胞的早期胚胎是通过实验小鼠(Mus musculus domesticus)和与之是同属异种关系的Mus spretus小鼠相互杂交或体外受精获得的。
(7)上述(1)到(5)任一制备方法，其中不能形成生殖细胞的早期胚胎是通过c-kit突变产生的胚胎。
(8)一种嵌合动物，能够通过上述(1)到(7)任一制备方法制备，其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
(9)一种雄性嵌合动物，其能够通过上述(1)到(7)任一制备方法制备，并且其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
(10)一种雌性嵌合动物，其能够通过上述(1)到(7)任一制备方法制备，并且其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
(11)上述(8)-(10)任一种嵌合动物，其中动物是小鼠。
(12)一种制备杂合动物的方法，其中一个染色体对中的一条染色体衍生自全能细胞，包括将所希望的雌性动物品系与雄性嵌合动物杂交，其中该雄性嵌合动物的生殖细胞衍生自被导入的全能细胞，或者通过体外受精或胞质内精子注射，用从雄性嵌合动物获得的精子细胞使所希望品系的卵母细胞受精，以获得胚胎；以及将如此获得的胚胎移植入受体动物从而导致个体的发生。
(13)一种制备杂合动物的方法，其中一个染色体对中的一条染色体衍生自全能细胞，包括将所希望的雄性动物品系与雌性嵌合动物杂交，其中该雌性嵌合动物的生殖细胞衍生自被导入的全能细胞，或者通过体外受精或胞质内精子注射，用所希望品系的精于细胞使获自雌性嵌合动物的卵母细胞受精，以获得胚胎；以及将如此获得的胚胎移植入受体动物从而导致个体的发生。
(14)一种制备纯合动物的方法，其中纯合动物通过进行杂交、人工授精、体外受精，或胞质内精子注射，使用从上述(9)和(10)获得的雄性和雌性嵌合动物而制备。
(15)上述(12)-(14)任一种制备方法，其中动物是小鼠。
(16)一种杂合动物，通过上述(12)-(14)任一种制备方法制备，其中染色体对中的一条染色体衍生自全能细胞。
(17)一种纯合动物，通过上述(12)-(14)任一种制备方法制备，以及通过雄性杂合动物与雌性杂合动物杂交而获得，该杂合动物中染色体对中的一条染色体衍生自全能细胞。
(18)上述(16)或(17)的动物，其中动物是小鼠。本发明的嵌合动物通过向遗传上不能形成生殖细胞的早期胚胎注射全能细胞，比如ES细胞，而得以制备。所有获得的嵌合动物的生殖细胞衍生自被注入的全能细胞，比如使用ES细胞时的ES细胞。在下面的例子中，ES细胞被作为全能细胞的例子加以阐述。但是，用于此处的全能细胞并不限于ES细胞。所有获得的嵌合动物的精子细胞或卵母细胞衍生自ES细胞。此外，衍生自ES细胞的染色体总是会传递给幼仔，并且染色体对中的一条是来自ES细胞基因的杂合子。
不能形成生殖细胞的早期胚胎，如胚胎，能够利用由于遗传因子导致的生殖细胞低常增生而得到。为此，建议两类方法。具体的，由于种间F1代杂种雄性小鼠显示不育，来自种间杂交的胚胎通过用实验小鼠(Mus musculus domesticus)和与之是同属异种关系的小鼠自然交配而获得。同时，优选的是从具有出色增殖能力的雌性实验小鼠中获得卵母细胞。具体地讲，优选的是通过用雌性实验小鼠(Mus musculus domesticus)和与它是同属异种关系的雄性小鼠自然交配而获得种间杂交的胚胎。尤其是，更多的胚胎能够通过对3-4周大的年轻实验雌性小鼠经受激素处理以诱导超数排卵，然后通过杂交而获得。
此外，其通过在从超数排卵诱导的年轻雌性实验小鼠中收集来的卵母细胞和异种小鼠的精子细胞之间进行体外受精可以有效地获得大量种间杂种胚胎。C57BL/6小鼠等能够用作实验小鼠。
同时，Mus spretus，Mus caroli，Mus pahari，等能够被用作用于进行杂交的异种小鼠。由于收集到相对大量的体外受精方面的信息，特别优选Mus spretus。特别优选C57BL/6雌性小鼠与Musspretus雄性小鼠的结合，因为种间杂交胚胎能够从该结合中稳定的获得。
此外，作为第二种方法，c-kit突变小鼠(Wv/W或W/Wv)的胚胎，例如，利用发生生殖细胞的低常增生这一事实，通过Wv/+和W/+小鼠彼此杂交或体外受精能够制备此种胚胎。尤其是当使用Wv/W或W/Wv胚胎时，雌性种系嵌合体能够通过使用雌性ES细胞而产生。
所有如此获得的胚胎都是遗传上不能形成生殖细胞的胚胎。结果是，在通过ES细胞注射胚胎而获得的嵌合小鼠生殖细胞中，所有形成的精子细胞或卵母细胞均衍生自ES细胞。
如此获得的雄性嵌合小鼠的精子细胞(生殖细胞)衍生自ES细胞，并且通过实验雌性小鼠与嵌合小鼠杂交获得的幼崽是具有ES细胞的一对染色体中的一条染色体的杂合动物。如此获得的嵌合小鼠是衍生自ES细胞的种系嵌合小鼠。此外，当获得的嵌合小鼠精子细胞的数量低或者精子活力低时，受精不能通过自然交配完成。但是，即使是这种情况，也能够通过收集精子细胞并使用例如胞质内精子注射(ICSI)的技术获得幼崽。另一方面，当使用Wv/W胚胎时，雌性种系嵌合动物能够通过使用雌性ES细胞而获得。当产生的基因被改变的动物，其中发生的是线粒体或类似的基因改变时，使用这种胚胎是有利的。
如上所述，根据本发明能够有效地制备种系嵌合动物。应用本发明，可以预测基因被改变的小鼠，比如敲除小鼠，能够从几乎从未成功过的近亲交配小鼠衍生出的ES细胞中产生。此外，基因被改变的小鼠也可以从ES细胞获得，而从该ES细胞中还从未获得过种系嵌合动物。除了ES细胞，如果细胞是全能细胞，应用于本发明也是可能的。
尽管在上述说明中使用的是小鼠；但是，该操作能够应用于所有哺乳动物。例如，就家养动物而言，有效的种系嵌合动物是通过制核移植备体细胞或基因被改变的体细胞的克隆胚胎，然后应用本发明的方法制备的。此外，本发明的方法也能够应用于实验动物比如鸟、爬行动物、两栖动物和鱼类。在那些例子中，非整倍染色体的胚胎能够被用作不育胚胎。本发明的方法也能够用于野生动物。
此外，雄性和雌性杂合动物，能够从本发明获得的嵌合动物的下一代幼崽中获得，其中，杂合动物的一对染色体中的一条染色体来自ES细胞，且嵌合动物中的所有生殖细胞衍生自ES细胞。此外，纯合动物(纯合型基因被改变的动物)能够通过雄性杂合动物与如此获得的雌性杂合动物杂交而产生。本发明将通过所涉及的实施例作进一步的具体描述。但是，这些例子仅仅用于提供一些例证，本发明并不限于这些例子。
实施例1制备用于嵌合体制备的胚胎(1)不能形成雄性生殖细胞的胚胎的获得给具有Mus spretus型线粒体的3.5周大的C57BL/6雌性小鼠(B6-mtSPEC57BL/6小鼠，其中通过回交，胞质线粒体被野生型衍生的近亲交配Mus spretus小鼠的线粒体所替代)的腹腔施用每只小鼠5IU/0.05ml/的受孕母马的血清促性腺激素(PMSG)。48小时后，给每只小鼠施用5IU/0.05ml的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，以便进行超数排卵诱导处理。接下来，受到超数排卵诱导处理的雌性小鼠与性成熟(6周大或更大)的雄性野生型衍生的近亲交配Musspretus小鼠自然交配，通过允许他们生活在一起而实现。在确定交配后第3.5天，取出雌性小鼠的子宫。用M2培养液(94.7mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，4.00mMNaHCO3，21.0mM HEPES，23.3mM乳酸钠，0.33mM丙酮酸钠，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素)灌注该子宫，从而收集胚胎。用同样的培养液洗涤该胚胎，从而制备同属异种的胚胎(胚泡期胚胎)。
同时，当同属异种的胚胎通过体外受精制备时，根据上述方法(施用hCG后16小时)进行超数排卵诱导处理的C57BL/6雌性小鼠被实施脊椎错位无痛致死术。从小鼠中取出输卵管，然后与用矿物油覆盖的mTYH培养液(199.37mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mMKH2CO3，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，1.00mM丙酮酸钠，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素)的矿物油滴部分接触。接下来，用两个27G注射针在立体显微镜下将输卵管捣碎，然后包含有卵母细胞的堆积细胞组被导入mTYH培养液滴中。此外，细胞组应被小心地导入，以防止输卵管进入培养液从而防止造成血液和组织污染。通过给每个雄性Mus spretus小鼠实施脊椎错位无痛致死术，取出附睾尾，用Kimwipe擦去附在附睾尾上的血液，当用手指撑住管道时，用23G注射针做一个切口，然后，用注射针从管道中敲碎精子块，从而准备出要预培养的精子细胞。然后精子细胞被导入0.3ml的用矿物油覆盖的mTYH培养液(液体)或mTYH培养基(199.37mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mMMgSO4，25.07mM NaHCO3，1.00mM丙酮酸钠，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素)，接着在CO2培养箱中培养2-8个小时。如此预培养的精子细胞以1至5×105精子细胞/ml的精子终浓度向含有预先准备的卵母细胞的受精培养液(mTYH培养液)中受精。经过受精作用的卵母细胞被培养在CO2培养箱中培养8-10个小时。接下来，用补加了0.1mL的EDTA的M16培养液(94.59mMNaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，23.28mM乳酸钠，0.33mM丙酮酸钠，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素)洗涤卵母细胞进行发育。然后，转入同样的培养液中。在立体显微镜下确定受精卵之后，卵被培养在CO2培养箱中96个小时，从而制备出胚泡期胚胎。
(2)不能形成雄性和雌性生殖细胞的胚胎的获得使用具有参与生殖细胞形成的c-kit突变的雄性或雌性W品系杂合小鼠实施杂交或体外受精，然后根据(1)中所描述方法制备Wv/W或W/Wv杂合体的胚胎，从而制备出胚泡期胚胎。
实施例2嵌合小鼠的制备根据标准方法，近亲交配C57BL/6衍生的ES细胞(Mus musculusdomesticus型线粒体DNA)被注射入胚泡期胚胎中(Mus spretus型线粒体DNA)，该胚泡期胚胎通过将具有如实施例1所描述的野生型衍生的近亲交配Mus spretus精子细胞与具有Mus spretus型线粒体DNA的近亲交配雌性C57BL/6小鼠(B6-mtSPE)的卵母细胞进行体外受精而制备。使用了48个胚泡期胚胎。一个胚胎中注入5个ES细胞，从而获得48个被注射的胚胎。在3个6周大白子受体雌性CD-1小鼠与8周大的结扎输精管的雄性小鼠杂交之后的第二天，将16个受到注射的胚胎移植到该受体雌性CD-1小鼠的子宫中，由此获得3个嵌合幼崽。
实施例3嵌合小鼠种系谱系实施例2获得的雄性嵌合小鼠生长到它们性成熟。根据皮毛的颜色(低度镶嵌性、中度低度镶嵌性、黑色)，筛选出三种类型的小鼠，然后从附睾尾收集精子细胞。通过对如此获得的精子线粒体DNA进行PCR分析来确定生殖细胞谱系。当精子细胞衍生自ES细胞，Musmusculus domesticus型线粒体DNA能被检测到；而当衍生自受精卵，Mus spretus型线粒体能被检测到。嵌套式PCR方法分析的结果(Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546(1995))显示，所有获自这些小鼠的精子细胞衍生自ES细胞。此外，在通过C57BL/6小鼠(B6-mtSPE)的卵母细胞和Mus spretus精子细胞体外受精得到的种间F1代雄性小鼠杂种中，没有精子细胞可以被确认，并且没有幼崽可以通过与C57BL/6小鼠杂交而获得。因此，可以肯定种间F1代雄性小鼠杂种不能够形成生殖细胞。根据本发明获得的嵌合动物所产生的生殖细胞衍生自被注射的ES细胞。因此，通过嵌合动物与所希望的品系杂交，或者通过获自嵌合动物的精子细胞与所希望品系的卵母细胞体外受精，然后移植所获得的受精卵至受体动物以获得幼崽的方法来得到雄性和雌性杂合动物，其中一对染色体中的一条染色体衍生自ES细胞。纯合动物能够通过将如此获得的雌性杂合动物与雄性杂合动物杂交而产生。一般的，能够使用预先通过同源重组或类似方法产生的所希望的基因改变的ES细胞，作为这里所使用的ES细胞。因此，基因被改变的杂合动物能够很容易获得。此外，当使用c-kit突变小鼠胚胎时，比如通过用Wv/+小鼠和W/+小鼠彼此杂交或者体外受精而获得的Wv/W或W/Wv胚胎被使用时，是不可能既形成雄性又形成雌性生殖细胞的。因此，不管ES细胞是雄性还是雌性，被注射的ES细胞贡献于所有获得的嵌合小鼠的生殖细胞，因此，种系嵌合动物能够用雌性或雄性ES细胞制备(这里使用的ES细胞不限于雄性ES细胞)。
此外，根据本发明制备的所有嵌合动物生殖细胞衍生自ES细胞。因此，具有ES细胞一对染色体中的一条染色体的雄性和雌性杂合体能够通过与雄性嵌合动物杂交或者用同样的个体体外受精而产生。如此获得的雄性和雌性杂合体能够彼此杂交从而能够轻易的获得纯合体，所以它们对于基因功能分析非常有用。此外，具有ES细胞一对染色体中的一条染色体的雄性和雌性杂合体能够通过应用由改变基因的雌性ES细胞所产生的雌性嵌合动物杂交或者进行人工授精而获得。纯合体能够很容易地通过将如此获得的雌性杂合体与雄性杂合体进行类似的杂交而获得。此外，认为纯合体能够也通过雌性嵌合动物与雄性嵌合动物杂交而获得。通过上述方法获得的基因被改变的动物在基因功能分析方面非常有用。
如上所描述，方便地实施这些操作已经成为可能，从而使有效地生产种系嵌合动物成为可能，而这种生产常规上是低效的。
权利要求
1.一种制备种系嵌合动物的方法，其中生殖细胞衍生自全能细胞，该方法使用不能形成生殖细胞和全能细胞的早期胚胎。
2.权利要求1的制备方法，其中不能形成生殖细胞的早期胚胎是胚胎、核移植胚胎或通过种间杂交获得的转基因胚胎。
3.权利要求1或2的制备方法，其中全能细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖细胞(EG细胞)。
4.权利要求1或2的制备方法，其中全能细胞是核移植胚胎或胚胎干细胞(ES细胞)或衍生自核移植胚胎的胚胎生殖细胞(EG细胞)。
5.权利要求1到4中任一项的制备方法，其中所述动物是小鼠。
6.权利要求5的制备方法，其中所述不能形成生殖细胞的早期胚胎是通过实验小鼠(Mus musculus domesticus)和与之是同属异种关系的Mus spretus小鼠相互杂交或体外受精获得的胚胎。
7.权利要求1到5中任一项的制备方法，其中所述不能形成生殖细胞的早期胚胎是通过c-kit突变产生的胚胎。
8.一种嵌合动物，其能够通过上述权利要求1到7中任一项的制备方法制备，其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
9.一种雄性嵌合动物，其能够通过上述权利要求1到7中任一项的制备方法制备，其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
10.一种雌性嵌合动物，其能够通过上述权利要求1到7中任一项的制备方法制备，并且其中生殖细胞衍生自被导入的全能细胞。
11.权利要求8到10中任一项的嵌合动物，其中所述动物是小鼠。
12.一种制备杂合动物的方法，其中染色体对中的一条衍生自全能细胞，其包括将所希望的雌性动物品系与雄性嵌合动物杂交，其中所述雄性嵌合动物的生殖细胞衍生自被导入的全能细胞，或者通过体外受精或胞质内精子注射，用从雄性嵌合动物获得的精子细胞使所希望品系的卵母细胞受精，以获得胚胎；以及将如此获得的胚胎移植入受体动物从而导致个体的发生。
13.一种制备杂合动物的方法，其中染色体对中的一条衍生自全能细胞，其包括将所希望的雄性动物品系与雌性嵌合动物杂交，其中该雌性嵌合动物的生殖细胞衍生自被导入的全能细胞，或者通过体外受精或胞质内精子注射，用所希望品系的精子细胞使获自雌性嵌合动物的卵母细胞受精，以获得胚胎；以及将如此获得的胚胎移植入受体动物从而导致个体的发生。
14.一种制备纯合动物的方法，其中所述纯合动物通过权利要求9和10获得的雄性和雌性嵌合动物进行杂交、人工授精、体外受精，或胞质内精子注射而获得。
15.权利要求12到14中任一项的制备方法，其中所述动物是小鼠。
16.一种杂合动物，其通过权利要求12到14中任一项的方法制备，其中染色体对中的一条衍生自全能细胞。
17.一种纯合动物，其通过权利要求12到14中任一项的方法制备，以及通过雄性杂合动物与雌性杂合动物杂交而获得，该杂合动物中染色体对中的一条衍生自全能细胞。
18.权利要求16或17的动物，其中所述动物是小鼠。
全文摘要
本发明提供一种有效制备种系嵌合动物的方法，以及提供一种方便地制备杂合动物和纯合动物的方法。具体地，其生殖细胞衍生自被导入的ES细胞的嵌合动物通过向由于遗传因子而不能形成生殖细胞的早期胚胎(胚泡期胚胎)注射胚胎干细胞(ES细胞)而产生。纯合体通过从所得到的嵌合动物而来的雌性杂合体与雄性杂合体杂交而获得。如此获得的嵌合动物对于进行基因功能分析或类似分析极其有用。
文档编号A01K67/027GK1649489SQ0380944
公开日2005年8月3日 申请日期2003年2月27日 优先权日2002年2月27日
发明者长尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 户塚义和 申请人:长尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 户塚义和