本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种建立石蒜再生体系的方法。
背景技术：
中国石蒜(Lycoris chinensis Traub)为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris Herb.)多年生草本植物。鳞茎卵球形，春季出叶，叶带状，伞形花序有小花5-6朵；花黄色；花被裂片强度反卷和皱缩。花期7-8月。花茎挺拔，花形优美，花色艳丽，具有很高的观赏价值，现已逐渐成为新型的鲜切花、园林地被和盆栽的球根花卉。
自然状态下，中国石蒜及其他石蒜属植物一般以自然分球繁殖为主，但繁殖系数低，一个开花球平均每年分生1～2个球，子球开花需3～4年左右时间；即使正常结实，从种子萌发到开花一般需要5-6年的时间；而石蒜属许多种类不易正常结实。因此，分球繁殖的速度慢，繁殖周期长，是整个石蒜属植物的推广应用中面临的一个难题。除此之外，可利用再生体系建立过程中产生的愈伤组织，对其进行分子生物学水平的改良或进行其他遗传操作。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种建立石蒜再生体系的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种建立石蒜再生体系的方法，包括以下步骤：1)将地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎；2)将所述新生鳞茎接入到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养获得直径1.5～2.5cm的愈伤组织；3)将所述愈伤组织切割为直径1.0～1.5cm的团块后接种到芽诱导培养基中进行愈伤组织的分化15～20d得到丛生芽；4)将所述丛生芽接种到壮芽生根培养基进行壮芽和生根培养得到试管苗。
优选的，步骤1)中所述的壮芽培养包括2～3次继代培养，每次继代培养的时间为25～35d；所述壮芽培养的温度独立的为24～26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h/d。
优选的，步骤1)中所述壮芽培养用培养基为包括35～45g/L蔗糖，5～10g/L琼脂，1.5～2.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.1～0.3mg/L萘乙酸的MS培养基。
优选的，步骤2)中所述的愈伤组织诱导培养基为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，5.5～6.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.0～2.0mg/L萘乙酸的MS培养基。
优选的，步骤2)中所述的暗培养包括25～35d的原代暗培养和25～35d的继代暗培养，所述暗培养的温度为24～26℃。
优选的，步骤1)中所述的诱导丛生芽是在芽诱导培养基中进行的，所述芽诱导培养基为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，2.5～3.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.0～2.0mg/L萘乙酸的MS培养基。
优选的，步骤1)中所述的诱导丛生芽包括原代诱导培养和继代诱导培养，所述原代诱导培养的时间为35～45d，继代诱导培养的时间为35～45d；步骤3)中所述愈伤组织的分化仅包括丛生芽原代诱导培养；所述诱导丛生芽的培养温度24～26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间10～14h/d。
优选的，步骤1)中所述增殖不定芽步骤是在芽增殖培养基中进行增殖培养，所述芽增殖用培养基为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，2.5～3.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.5～1.5mg/L萘乙酸的MS培养基；所述增殖不定芽培养温度为24～26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h/d；所述增殖不定芽培养的时间为35～45d。
优选的，步骤4)中所述壮芽生根培养基为包括35～45g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，3.5～4.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.1～0.3mg/L萘乙酸和1.5～2.5mg/L的吲哚丁酸的MS培养基。
优选的，步骤4)中所述石蒜苗的直径为3～5mm，根系为3～5条。
本发明的有益效果：本发明提供的建立石蒜再生体系的方法，通过将石蒜地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎后，诱导新生鳞茎产生愈伤组织，再经由愈伤组织诱导出丛生芽，经由愈伤组织诱导出的丛生芽数量多，生长速度快，大幅度的提高了其繁殖系数，同时加快了繁殖的速度，繁殖周期为5～6个月；并且在愈伤组织的基础上可以对其进行多种遗传操作，从分子生物学水平改良遗传性状。
具体实施方式
本发明提供了一种建立石蒜再生体系的方法，包括以下步骤：1)将石蒜地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎；2)将新生鳞茎接入到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养获得直径1.5～2.5cm的愈伤组织；3)将愈伤组织切割为直径1～2cm的团块后接种到芽诱导培养基中进行愈伤组织的分化15～20d得到丛生芽；4)将丛生芽接种到壮芽生根培养基中进行壮芽生根培养后获得组培苗。
本发明将石蒜地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎。所述石蒜品种优选为中国石蒜；所述的石蒜地下鳞茎优选为3年生以上，更优选为3～5年生，直径1.5～4cm的地下鳞茎。本发明在对地下鳞茎灭菌前，优选的对地下鳞茎进行预处理得到块状鳞茎；所述的预处理包括获得鳞茎盘、对鳞茎盘进行清洗、切块和洗涤。
本发明优选去除地下鳞茎的外层鳞叶，切除地下鳞茎全部的根和1/2～2/3的鳞叶，保留鳞茎盘；所述清洗优选的使用毛刷、清水洗去鳞茎盘表面泥土；所述切块获得的块状鳞茎盘大小优选为1.0～1.5cm3；所述洗涤优选为震荡洗涤，所述洗涤所用的洗涤液优选为84消毒液；所述洗涤的时间优选为15～50min，更优选为25～40min。所述洗涤后，本发明优选采用流动清水冲洗所述洗涤后的鳞茎盘25～35min。
本发明在得到鳞茎盘后，对所述鳞茎盘进行灭菌。所述灭菌操作优选的在超净工作台内进行；所述灭菌优选的包括酒精漂洗、HgCl2灭菌和无菌水冲洗。在本发明中，所述酒精漂洗所用酒精的为体积分数优选为70～80％，更优选为75％；所述酒精漂洗的时间优选为25～35s，更优选为30s。在本发明中，所述HgCl2灭菌用HgCl2溶液的质量分数优选为0.05～0.15％的HgCl2溶液；所述HgCl2溶液灭菌的时间优选为35～45m in，更优选为40min。在本发明中，所述无菌水冲洗的次数优选为4～6次，更优选为5次。本发明在无菌水冲洗完成后，优选的采用无菌纸吸干鳞茎盘表面的水分。
所述灭菌后，本发明在将所述灭菌后的鳞茎进行诱导丛生芽。本发明中优选将已灭菌的块状鳞茎以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基进行培养；所述芽诱导培养基优选为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，2.5～3.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1～2.0mg/L萘乙酸的MS培养基；更优选为包括30g/L的蔗糖，7.5g/L的琼脂，3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.5mg/L萘乙酸的MS培养基。
本发明中所述诱导丛生芽的过程优选的包括原代培养和继代培养，具体为：将所述灭菌后的鳞茎在芽诱导培养基上依次进行原代培养和继代培养。在本发明中，所述原代培养的时间优选为35～45d，更优选为40d；所述继代培养的时间优选为35～45d，更优选为40d；所述诱导丛生芽的培养温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述诱导丛生芽的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；光照的时间优选为10～14h/d，更优选为12h/d。
本发明在诱导丛生芽后，将得到的鳞茎丛生芽进行增殖不定芽，具体为将所述诱导丛生芽得到的移植到芽增殖培养基中，进行不定芽增殖。在本发明中，所述芽增殖培养基优选为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，2.5～3.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.5～1.5mg/L萘乙酸的MS培养基，更优选为包括30g/L的蔗糖，7.5g/L的琼脂，3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.0mg/L萘乙酸的MS培养基。
在本发明中，所述增殖不定芽的培养温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述增殖不定芽的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述光照的时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d；所述增殖不定芽培养的时间优选为35～45d，更优选为40d。
本发明在完成不定芽增殖后，将得到的鳞茎不定芽进行壮芽培养，获得新生鳞茎。在本发明中，所述的壮芽培养优选的包括2～3次继代培养，每次继代培养的时间优选为25～35d；更优选为30d。本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述壮芽培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。
在本发明中，所述壮芽培养具体为：将增殖不定芽得到的鳞茎不定芽移栽到壮芽培养基上进行壮芽培养。在本发明中，所述壮芽培养用培养基优选为包括35～45g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，1.5～2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤
和0.1～0.3mg/L萘乙酸的MS培养基；更优选为包括30g/L的蔗糖，7.5g/L的琼脂，2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.2mg/L萘乙酸的MS培养基。
在本发明所述壮芽培养完成后，得到直径2～4mm的新生鳞茎。
本发明在获得新生鳞茎后，将新生鳞茎接入到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养获得愈伤组织。本发明中所述的愈伤组织诱导培养基优选为包括25～35g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，5.5～6.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.0～2.0mg/L萘乙酸的MS培养基；更优选为包括30g/L的蔗糖，7.5g/L的琼脂，6.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.5mg/L萘乙酸的MS培养基。
在本发明中，所述暗培养优选包括原代培养和继代培养，所述原代培养和继代培养的时间独立的优选为25～35d，更优选为30d。本发明中所述暗培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。本发明中新生鳞茎在暗培养15d后鳞茎周围出现白色突起，为愈伤组织萌动，20d后白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的初期的愈伤组织，继代培养后可获得直径1.5～2.5cm的愈伤组织。
本发明在获得愈伤组织后，优选的将愈伤组织切割成团块接种到芽诱导培养基中进行愈伤组织的分化，得到丛生芽。本发明将所述的愈伤组织切割为直径1～2cm的团块后再进行接种分化。在本发明中，所述愈伤组织分化用芽诱导培养基与上述技术方案所述诱导丛生芽用芽诱导培养基范围内自行选择即可；愈伤组织分化培养的条件与诱导丛生芽步骤中的条件相同，此处不再赘述。
本发明中，采用愈伤组织分化得到的丛生芽长势健壮，数量众多，生长速度快，因此本发明采用愈伤组织分化得到的丛生芽提高了石蒜繁殖系数，加快了其繁殖的速度。
本发明在获得丛生芽后，将所述丛生芽接种到壮芽培生根培养基中进行壮芽生根培养后获得组培苗。在本发明中所述的壮芽生根培养所用培养基为包括35～45g/L的蔗糖，5～10g/L的琼脂，3.5～4.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.1～0.3mg/L萘乙酸和1.5～2.5mg/L的吲哚丁酸的MS培养基。更优选为包括30g/L的蔗糖，7.5g/L的琼脂，3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/L萘乙酸和2.0mg/L吲哚丁酸的MS培养基。
本发明中，壮芽生根培养的培养条件与上述壮芽培养获得新生鳞茎的培养条件的相同，此次不再赘述。
本发明获得的石蒜组培苗苗的直径优选为3～5mm，更优选为4mm；所述石蒜苗的根系优选为3～5条，更优选为4条。
本发明在得到组培苗后，优选对其进行炼苗和移栽。在本发明中，所述炼苗在室内进行，将石蒜苗置于自然散射光下，放置2～3d完成炼苗。
本发明在炼苗完成后，进行所述炼苗后的石蒜苗移栽。在本发明中，所述移栽优选洗去石蒜苗根部的培养基，移栽到穴盘中，所述穴盘的规格优选为10×10。
在本发明中，石蒜苗移栽后的栽培基质优选包括泥炭土、珍珠岩和田园土；所述泥炭土、珍珠岩和田园土的质量比优选为1:1:1；本发明中所述栽培基质优选的经过800～1000倍多菌灵消毒处理后使用。
在本发明中，组培苗移栽完成后，进行正常的水肥管理获得成熟的石蒜苗。
下面结合实施例对本发明提供的石蒜快速繁殖培养的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取直径2.0cm、健康的中国石蒜地下鳞茎，剥去外层鳞叶，切除全部根和鳞茎上半部分1/2，保留鳞茎盘，毛刷洗净根部表面的泥土，根据鳞茎盘大小切成4块，每块大小1.0cm2，84洗涤剂震荡洗涤30min，流水冲洗30min，备用。
上述材料在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，0.1％HgCl2灭菌40min，无菌水冲洗4遍，无菌吸水纸吸干表面的水分。
将已灭菌的鳞茎块，以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA。经过28d的培养后，从外植体的鳞片间长出小芽。40d后进行继代培养。培养温度25℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间12h/d。
不定芽继代培养40d后，转接到芽增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。培养温度25℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。培养温度25℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将从生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基上，每30d继代一次，共培养90d，丛生芽长成直径3mm的新生鳞茎。培养温度25℃，光照强度270μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
将壮芽培养后长出的新生鳞茎转接到一下培养基中：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA2周后，小鳞茎的周围出现白色的突起，为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度为25℃，暗培养。
将愈伤组织切下，分成直径1.5cm的小块，转接到上述芽诱导培养基上，进行丛生芽的诱导。培养方法与芽诱导步骤相同。每块愈伤组织分化出9个小芽。
将上述丛生芽转接到壮芽生根培养基上，进行壮芽生根培养。培养温度26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。壮芽生根培养基为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.0mg/L IBA，培养30d后，即可长成直径4mm、根系4条的组培苗。
将组培苗苗进行炼苗和移栽，炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置3d。炼苗完成后，用镊子将石蒜苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经800倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理获得成熟的中国石蒜。
本实施例得到石蒜苗的整个周期大约是5～6个月时间。
实施例2
取直径3.0cm、健康对的中国石蒜地下鳞茎，剥去外层鳞叶，切除全部根和鳞茎上半部分2/3，保留鳞茎盘，毛刷洗净根部表面的泥土，根据鳞茎盘大小切成4块，每块大小1.0cm2，84洗涤剂震荡洗涤28min，流水冲洗33min，备用。
上述材料在超净工作台上用75％的酒精漂洗33s，0.1％HgCl2灭菌42min，无菌水冲洗5遍，无菌吸水纸吸干表面的水分。
将已灭菌的鳞茎块，以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA。经过28d的培养后，从外植体的鳞片间长出小芽。40d后进行继代培养。培养温度26℃，光照强度220μmol·m-2·s-1，光照时间12h/d。
不定芽继代培养40d后，转接到芽增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。培养温度24℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。培养温度25℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将从生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基上，每30d继代一次，共培养60d，丛生芽长成直径3mm的新生鳞茎。培养温度25℃，光照强度270μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
将壮芽培养后长出的新生鳞茎转接到一下培养基中：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA2周后，小鳞茎的周围出现白色的突起，为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径5cm的愈伤组织团块。培养温度为25℃，暗培养。
将愈伤组织切下，分成直径1.5cm的小块，转接到上述芽诱导培养基上，进行丛生芽的诱导。培养方法与芽诱导步骤相同。每块愈伤组织分化出芽11个。
将上述丛生芽转接到壮芽生根培养基上，进行壮芽生根培养。培养温度25℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。壮芽生根培养基为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA，培养30d后，即可长成直径3mm、根系4条的组培苗。
将组培苗进行炼苗和移栽，炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置2d。炼苗完成后，用镊子将石蒜苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经900倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理获得成熟的中国石蒜。
本实施例得到石蒜苗的整个周期大约是5～6个月时间。
实施例3
取直径4.0cm、健康对的中国石蒜地下鳞茎，剥去外层鳞叶，切除全部根和鳞茎上半部分3/5，保留鳞茎盘，毛刷洗净根部表面的泥土，根据鳞茎盘大小切块，每块大小1.2cm2，84洗涤剂震荡洗涤33min，流水冲洗30min，备用。
上述材料在超净工作台上用75％的酒精漂洗28s，0.1％HgCl2灭菌35min，无菌水冲洗3遍，无菌吸水纸吸干表面的水分。
将已灭菌的鳞茎块，以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA。经过28d的培养后，从外植体的鳞片间长出小芽。40d后进行继代培养。培养温度26℃，光照强度220μmol·m-2·s-1，光照时间12h/d。
不定芽继代培养40d后，转接到芽增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。培养温度24℃，光照强度150μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。培养温度25℃，光照强度260μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将从生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基上，每30d继代一次，共培养90d，丛生芽长成直径2.5mm的新生鳞茎。培养温度25℃，光照强度300μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d。
将壮芽培养后长出的新生鳞茎转接到一下培养基中：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA2周后，小鳞茎的周围出现白色的突起，为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径5cm的愈伤组织团块。培养温度为25℃，暗培养。
将愈伤组织切下，分成直径1.2cm的小块，转接到上述芽诱导培养基上，进行丛生芽的诱导，每块愈伤组织分化出10个芽。培养方法与芽诱导步骤相同。
将上述从生芽转接到壮芽生根培养基上，进行壮芽生根培养。培养温度25℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。壮芽生根培养基为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA，培养30d后，即可长成直径5mm、根系3条的组培苗。
将组培苗进行炼苗和移栽，炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置2d。炼苗完成后，用镊子将苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经1000倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理获得成熟的中国石蒜。
本实施例得到石蒜苗的整个周期大约是5～6个月时间。
由以上实施例可知，本发明提供的石蒜快速繁殖培养的方法，通过将石蒜地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎后，将新生鳞茎诱导为愈伤组织，再经由愈伤组织诱导出丛生芽，经由愈伤组织诱导出的丛生芽数量多，每块愈伤组织分化出9～11个芽，生长速度快，可大幅度的提高了石蒜繁殖系数，同时加快繁殖的速度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。