用于破除细菌生物被膜的消毒剂的制作方法

本发明涉及一种消毒剂。更具体地说，本发明涉及一种用于破除细菌生物被膜的消毒剂。

背景技术：

细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。生物被膜将导致产品污染。产品污染来源于生物被膜上脱落的细菌，这些细菌可以重新附着在产品生产过程中的其它设备上或是直接进入食品中。致病性微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要隐患。美国约80％的持续的细菌感染与细菌生物被膜有关(美国国立卫生研究院报告)。

研究表明，相对于处理食品或者环境中的游离细菌来说，细菌形成生物被膜后难以消除，必须通过高浓度消毒剂处理才能将生物被膜内的细菌杀死，而长期高浓度使用特定的消毒剂，不仅对环境和人体有害，并且使得细菌细胞产生了对常见消毒剂的抗性，更加难以处理，并且高度浓度的消毒剂，如酸等，会腐蚀食品加工企业的地面等，提高企业的生产成本。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种用于破除细菌生物被膜的消毒剂，其能够有效破除细菌生物被膜且成分简单，消毒成分浓度低，能够提高消毒剂的使用效果，降低消毒剂的使用量，减少对环境和人体的危害。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于破除细菌生物被膜的消毒剂，包括：按重量份计的以下组分：0.5-3重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。

优选的是，所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括按重量份计的以下组分：0.5-1重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。

优选的是，所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括按重量份计的以下组分：1重量份的苯乳酸、1重量份的乳酸以及100重量份的去离子水。本发明所使用的乳酸和苯乳酸均选用市售的sigma试剂。

优选的是，所述细菌生物被膜包括由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌形成的生物被膜。

优选的是，所述革兰氏阳性菌包括：李斯特菌或耐药性的肠球菌。

优选的是，所述革兰氏阴性菌包括：沙门氏菌或假单胞菌。

本发明至少包括以下有益效果：本发明基于意想不到的发现，即低浓度的苯乳酸(3-苯基乳酸)与乳酸具有协同作用，能够增强乳酸对细菌生物被膜的破坏能力。本发明通过研究分析，发现1重量份的乳酸中添加0.5-3重量份的苯乳酸可以大大加强其对生物被膜的消除能力。本发明所述消毒剂不仅能够破除由革兰氏阳性菌形成的生物被膜，同时对由革兰氏阴性菌形成的生物被膜也具有较强的破除能力，尤其是医疗和食品行业中常见的沙门氏菌和假单胞菌等形成的生物被膜。因此，本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂仅仅使用低剂量的苯乳酸添加到低剂量的乳酸中即可以破除细菌生物被膜，可以增加消毒液的杀菌效果，从而降低乳酸的使用浓度。本发明所述消毒剂组成成分简单，消毒成分浓度更低，生产成本更低，大大减少对环境和人体的危害。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂处理成熟早期的李斯特菌生物被膜后的失活程度效果图；

图2为本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂处理成熟后期的李斯特菌生物被膜的失活程度效果图。

具体实施方式

下面结合图例和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种用于破除细菌生物被膜的消毒剂，包括按重量份计的以下组分：0.5-3重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。按照该比例可以配置所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂的原液，在使用过程中加入100ml去离子水中进行使用。也可以在100ml去离子水中直接添加0.5-3g苯乳酸和1g乳酸来制备可以直接使用的消毒剂。所述乳酸的使用量可以一定范围任意选择，例如1-3g乳酸。由于在实际生产中发现，虽然乳酸和苯乳酸作为有效的杀菌剂，可以极大程度地消灭游离的革兰氏阳性菌，但是对于已经形成生物被膜的细菌，作用很有限。如果想有效破除生物被膜现有技术中选择加大乳酸使用量，或者利用大量复合消毒剂进行长时间消毒处理。但在消毒过程中，往往会因为大量的酸性物质对被消毒品造成破坏或污染。本发明基于在研究中意想不到的发现，即苯乳酸与乳酸复配可以大大增强消毒作用，尤其是在低剂量范围内的效果更加明显。通过研究分析以及大量实验结果证明，按照本发明的方法在1重量份的乳酸中加入0.5-3重量份的苯乳酸，能够最大程度地增强乳酸对生物被膜中细菌细胞壁的破坏作用，增强其破除生物被膜的作用。

在其中一个实施例中，所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括按重量份计的以下组分：0.5-1重量份的苯乳酸和1重量份的乳酸。在试验中发现，苯乳酸的添加量在最接近乳酸含量时其效果最优。

在其中一个实施例中，所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括按重量份计的以下组分：1重量份的苯乳酸、1重量份的乳酸以及100重量份的去离子水。在生产过程中，可以选择同等重量份的苯乳酸和乳酸进行混合制备，其生产方法简单，使用去离子水更有利于发挥二者的协同作用。

在其中一个实施例中，所述细菌生物被膜包括由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌形成的生物被膜。本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂不仅广谱性杀菌效果，而且能够破除由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌形成的生物被膜。所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂的适用范围大，应用广泛。

在其中一个实施例中，所述革兰氏阳性菌包括：李斯特菌或耐药性的肠球菌。李斯特菌是一种重要的食源性病原菌，能够在食品加工环境中存活，并且能够在各种食品加工设备的表面形成生物被膜。李斯特菌形成的生物被膜难以消除，并且已经表现出了对常见消毒剂如氯、酸和季铵盐等的抗性。本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂对李斯特菌生物被膜处理5min后，李斯特菌生物被膜内的细胞能够降低4.01log CFU/ml。

在其中一个实施例中，所述革兰氏阴性菌包括：沙门氏菌或假单胞菌。这两种细菌形成的生物被膜能够引起人畜疾病，导致伤口感染等状况发生。本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂对沙门氏菌生物被膜处理5min后，沙门氏菌生物被膜内的细胞能够降低3.87log CFU/ml。

实施例1

本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括1g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去离子水。

实施例2

本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括0.5g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去离子水。

实施例3

本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂包括3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去离子水。

对比例1

消毒剂中包含3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去离子水。

对比例2

消毒剂中包含3g的苯乳酸、1g的乳酸以及100ml的去离子水。

对比例3

选用复合消毒剂，其包含3％LVA和2％SDS。

本发明选用李斯特菌生物被膜对上述各实施例和对比例进行试验，方法如下：

1，菌种的培养首先将单核细胞增生李斯特菌在脑心浸液肉汤(BHI)中37℃培养24小时恢复菌种的活力，然后将菌液进一步接种到BHI培养基中培养到对数生长期，获得细菌总数约为10⁹CFU/mL的菌液，备用。

2，生物被膜的制备将菌数约10⁹CFU/mL的菌液使用新鲜的BHI液体培养基稀释100倍，然后分别取1ml上述稀释菌液加入到24孔聚苯乙烯板的每个孔中，将24孔板静态培养。同时制备多个含有菌液的24孔板，置于15℃培养4天或7天。在制备生物被膜期间，为了保持菌的活力，每隔24小时将每个孔中的菌上清液取出，轻轻加入新的BHI液体培养基。培养完毕后，轻轻吸掉上清菌液，然后使用PBS溶液洗涤3次，24孔板底部即形成生长到成熟期的李斯特菌生物被膜。

3.选用各消毒剂对生物被膜的处理

生物被膜培养结束后，弃去上清液，使用0.01M磷酸盐缓冲缓进行漂洗三次，将24孔板空气干燥5分钟，然后使用不同消毒剂进行消毒处理，无菌水为阴性对照。每个孔中分别加入2ml试剂，处理时间5分钟。处理结束后，将每个空中充满了2毫升N/E中和肉汤(Becton Dickinson)，静止10分钟后，吸净液体，然后每个孔中加入1ml PBS，使用一个无菌的棉签彻底刮去表面的生物被膜，将含有生物被膜样品的PBS溶液和棉签都加入到含有9mlPBS溶液的试管中，漩涡震荡1分钟使得生物被膜破裂，释放游离细胞，然后将溶液进行梯度稀释，最后取合适梯度的稀释液100μl涂布在BHI平板中。在37℃培养48小时计数。存活细胞数记录见表1。

失活的程度表示为消毒处理的细胞存活率的log10(log N/N₀)。N是指经过消毒处理的样品中的细菌数，N₀是指不经过处理的阴性对照中的细菌数(阴性对照生物被膜)。失活的程度见图1和图2。从图1和图2中可以看出，本发明所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂对李斯特菌生物被膜的消灭能力最强。

表1各消毒剂处理不同成熟度的李斯特菌生物被膜5min后的残留菌数

表1中，可以明显看出实施例1所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂破除生物被膜的效果最优，存活的菌数最少，尤其是成熟度早期生物被膜内的细菌失活数高达4.26logCFU/ml。

采用上述方法，分别制备耐药性的肠球菌、沙门氏菌或假单胞菌的生物被膜，并使用各实施例和对比例制备的消毒剂对其进行处理，结果见表2，表3和表4。

表2各消毒剂处理不同成熟度的沙门氏菌生物被膜5min后的残留菌数

从表2中，可以明显看出实施例1所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂破除沙门氏菌生物被膜的效果最优，存活的菌数最少，尤其是成熟度早期生物被膜内的细菌失活数高达4.53log CFU/ml。

表3各消毒剂处理不同成熟度的肠球菌生物被膜5min后的残留菌数

从表3中，可以明显看出实施例1所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂破除肠球菌生物被膜的效果最优，存活的菌数最少，尤其是成熟度早期生物被膜内的细菌失活数高达4.04log CFU/ml。

表4各消毒剂处理不同成熟度假单胞菌生物被膜5min后的残留菌数

从表4中，可以明显看出实施例1所述用于破除细菌生物被膜的消毒剂破除假单胞菌生物被膜的效果最优，存活的菌数最少，尤其是成熟度早期生物被膜内的细菌失活数高达4.29log CFU/ml。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例和实施例。