一种防治人参和西洋参黑斑病和灰霉病的芽孢菌组合物及其用途的制作方法

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种防治人参和西洋参黑斑病和灰霉病的芽孢菌组合物及其用途。

背景技术：

人参是我国重要名贵中药材，野生资源基本枯竭，基本依靠栽培来满足人们需要。人参对土壤、水分、温度、光照等均有较高的要求，对环境要求极为苛刻，因此，人参栽培技术较高，生产成本也较高。即使在适宜的生长环境条件下，人参也常常发生病害，造成大面积减产，甚至失败，如果栽培人参中土壤、水分、温度、光照等条件不能较好满足人参生长要求，病害发生更为严重。人参病害达50余种，最常见的、危害最大的是人参黑斑病、灰霉病两种真菌性病害，发病率几乎为100％，对人参栽培产业危害极大，例如，早在1978年吉林省特产研究所对吉林省药用植物主要病虫害进行调查，指出人参黑斑病是人参的主要病害(研究论文“吉林省药用植物主要病虫害防治研究概述”发表于《中药材科技》1978年3期)；朱桂香、王崇仁、于训恕等人都分别调查研究了人参黑斑病，都指出人参黑斑病严重影响人参产量和质量(研究论文分别发表于《特产科学实验》1981年01期、《沈阳农业大学学报》1986年03期、《新农业》1985年09期)。目前在实际栽培人参过程中，通常采用严格的预防措施，每7～10天喷施化学农药进行，喷施的化学农药主要有代森锰锌、扑海因、波尔多液、防霉宝、速克灵、苯醚甲环唑、嘧菌环胺、嘧霉胺等。根据目前的栽培技术，几乎无法摆脱化学农药的应用。了解人参种植产业的人熟知：人参是用于人体保健的最重要滋补药材，俗称“百草之王”，但这种重要的保健药材又是“吃”农药长大的。即便如此，近些年来人参黑斑病的病情指数一般可达20％～30％，多者90％。

西洋参与人参都同属于五加科人参属，也是名贵中药材，西洋参除了临床药用外，还制成西洋参含片、冲泡粉剂等来作为日常保健用的食品，人群消费量和市场需求量大，在我国的栽培面积逐渐扩大。黑斑病、灰霉病同样严重发生在西洋参栽培过程中。目前，真菌性病害仍是人参、西洋参栽培过程中面临的最大问题。

大量使用农药的后果是人参药材农药残留较多。说明书附图1为喷洒农药后的人参地上部分照片，显示出人参叶片的残留农药。目前人参种植还必须采用遮荫蓬。在遮荫棚下的人参叶片上农药不能通过雨水淋洗而得到消除。2015年版《中国药典》第一部规定人参panaxginsengc.a.meyer.的药用部位为人参的干燥根和根茎及人参叶。而对于人参叶来说，以叶入药无疑会在药品中引入大量农药；不以叶入药，又会造成具有巨大药用价值的药用部位白白浪费。生物农药虽然无残留，但由于生物农药易于分解，药效发挥时间短，通常疗效较差，而对于化学农药都难以有效控制的人参病害来说，生物农药几乎无用武之地。

即使采用低残留化学农药，每月需喷洒3-4次，使用仍较为频繁。同时大量使用化学农药，不但造成农药成本和人工成本上升，而且存在农药残留危害；仍不能完全摆脱人参病害的危害，病害仍是制约人参栽培生产的关键问题。2016年国务院下发了《中医药发展战略规划纲要(2016-2030年)》将全面提升中药产业发展水平作为未来发展的重点任务之一，“促进中药材种植养殖业绿色发展，制定中药材种植养殖、采集、储藏技术标准”。

生态位是指一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的关系与作用，简单来说就是一个物种的食物、习性、栖息地等生活要素的集合。不同菌种的生活要素有重合部分，所以有很多物种在一特定环境中生存，任一环境因素的改变都可能会有利于其中的一种生物生存，而对其他生物生存不利。也就是说，自然界中生物物种繁多，有很多生物具有相似的生态位，生态位通常会发生不同程度的重合，生态位差异较小的物种间，竞争较为激烈。本发明专利中所涉及的生防菌与人参常见病害的黑斑病原菌、灰霉病原菌均生长在人参叶片上，生态位极为接近。因此，人为增加生防菌的数量，占据人参叶片一定空间，可消耗人参叶片表面的营养成分，而且本发明专利中所涉及的生防菌不仅无致病作用，而且适应性极强，从而可阻止植物病原菌的生长，减少病原菌的数量，使病害得到有效控制。

根据达尔文生物竞争理论，群落中不同物种之间、种内和种间的个体之间无时无刻不在进行着竞争，其中化学竞争是其中的一个方面。有些菌株可分泌一些化学物质，抑制其他物种的生长。因此采用对病原菌的拮抗菌株可有效防止病原菌的侵入。

根据生物入侵的理论，群落种群越复杂，外来物种越不容易入侵。外来物种容易入侵单一种群，如种植的农作物种群单一，病原菌容易侵入，病害严重。虽然目前市场上有枯草芽孢杆菌制剂，但由于菌株来源于非人参产区，菌种变异较大，而且采用的单一菌种通常也难以长期在叶片上生存，在实际应用中效果不佳，复合菌剂是一种很好的方法。

综合上述，人参病害的有效防治是人参栽培产业发展的一个关键的问题，目前仍需要探索一种高效方法解决控制人参病害发生，并减少农药使用。

技术实现要素：

本发明公开了一种对黑斑病、灰霉病防病效果好、药效持久的芽孢菌组合物生物农药，防病效果优于现有化学农药的疗效，而且该技术所生产的人参药材无农药残留。

生防菌能够长久“定居”人参叶片之上是影响防治效果的关键。最适宜人参叶片生态位的菌种是人参叶片的优势菌种。本发明专利采用多种芽孢杆菌优势菌种，并在每种芽孢菌中选择出对病原菌具有拮抗作用的菌株作为生防制剂。采用复合芽孢杆菌具有两个明显优势：首先，芽孢杆菌适应性强，耐高温、耐干旱，能够适应各种环境，菌体施入到叶片后容易定植。二是复合菌剂形成新群落更加稳定。三是受农药影响较小。对于人参广泛采用的广谱抗真菌制剂，因本发明菌剂采用的芽孢杆菌为细菌，广谱抗真菌制剂对其影响较小。

本发明所述的芽孢菌组合物的主要组成成分为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)和贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)三种菌中任意两种菌的组合制剂或三种菌的组合制剂。

所述芽孢菌组合制剂的适用对象和用途为防治人参和西洋参的黑斑病、灰霉病。

本发明公开了一株从人参分离得到的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌株已于2017年3月9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc))，保藏编号为cgmccno.13741，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为qh5s。

本发明公开了一株从人参分离得到的特基拉芽孢杆菌bacillustequilensis，该菌株已于2017年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13743，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为qh8t。

本发明公开了一株从人参分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)，该菌株已于2017年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc))，保藏编号为cgmccno.13742，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为qh6v。

本发明的一种实施方式是，一种芽孢菌组合物，由枯草芽孢杆菌cgmccno.13741、特基拉芽孢杆菌cgmccno.13743和贝莱斯芽孢杆菌cgmccno.13742组成；

优选地，枯草芽孢杆菌cgmccno.13741、特基拉芽孢杆菌cgmccno.13743和贝莱斯芽孢杆菌cgmccno.13742的活菌数的比例为(1～6)∶(1～2)∶(1～2)；

进一步优选地，枯草芽孢杆菌cgmccno.13741、特基拉芽孢杆菌(cgmccno.13743和贝莱斯芽孢杆菌cgmccno.13742的活菌数的比例为1.5∶1∶1。

本发明的一种实施方式是，一种含有权利要求上述任意一种的芽孢菌组合物的液体发酵物，所述液体发酵物的活菌数为1×10⁹～2×10¹⁰个/ml。

本发明的一种实施方式是，一种含有权利要求1-3任一项所述的芽孢菌组合物的菌制剂。

本发明进一步公开了上述芽孢菌组合物、液体发酵物、菌制剂用于预防和治疗人参和/或西洋参的黑斑病和/或灰霉病的用途。

同时，本发明还公开了所述枯草芽孢杆菌属(bacillussubtilis)细菌cgmccno.13741防治人参和/或西洋参的黑斑病和/或灰霉病的用途；

以及特基拉芽孢杆菌属(bacillustequilensis)细菌cgmccno.13743防治人参和/或西洋参的黑斑病和/或灰霉病的用途。

以及贝莱斯芽孢杆菌属(bacillusvelezensis)细菌cgmccno.13742防治人参和/或西洋参的黑斑病和/或灰霉病的用途。

所述的芽孢菌组合物的液体发酵物经过65～100目标准筛过滤后，加入适量润湿剂或表面活性剂后制成直接使用液体制剂，或再经过喷雾干燥制成固体粉末制剂。

所述菌制剂由本发明所述的芽孢菌，加上本领域常用的辅料制备而成。可以是片剂、颗粒剂、粉剂、水剂等。

本发明的优势效果表现在以下几点：

1、本发明所涉及的三种微生物均为非致病原菌，不影响药材的质量，有效防止人参药材无农药残留，并可生产出“符合绿色标准的人参”。

2、本发明所选用的三种菌表面有大量的鞭毛，三种菌相互之间有协同吸附定植于植物表面的效果，在植物叶片上吸附能力强，且扩散运动能力强，有显著地吸附于叶片的能力，在配制生产商品化制剂时大大减少了润湿剂、表面活性剂的用量，润湿剂、表面活性剂的用量可降低为其它传统制剂的二分之一。

3、本发明所选用的三种菌均为芽孢型细菌，具有两个明显优势：首先，芽孢杆菌适应性强，耐高温、耐干旱，能够适应各种环境，菌体施入到叶片后容易定植。二是受农药影响较小。

4、本发明所选用的三种菌均为经过拮抗实验证明对人参黑斑病、灰霉病两种真菌性病害病原菌有显著抑制作用的细菌，采用通过实验筛选所获得的他们特定配比的组合物作为生物制剂能发挥协同增效的优势效果，较单菌株和单菌株的其他组合对人参病虫害的防御作用显著增强。

5、本发明将为活体菌制剂，药效时间长，作用持久，防治效果优于传统化学农药。

附图说明

图1喷洒农药后的人参地上部分叶片的残留农药状况照片。

图2用本发明涉及的复合芽孢杆菌拮抗抑制黑斑病病原菌效果的实验照片，照片中培养平板的左侧两个菌落为黑斑病病原菌的菌落(菌落平均直径为19mm)，照片中培养平板的右侧两个菌落为在黑斑病病原菌的菌落周围的上下左右四个方位间距1cm接种复合芽孢杆菌后培养形成的菌落(菌落平均直径为8mm)，培养条件为25℃下用cpda培养基平板恒温培养72h。

微生物保藏

本发明公开了一株从人参分离得到的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌株已于2017年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc))，保藏编号为cgmccno.13741，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明公开了一株从人参分离得到的特基拉芽孢杆菌bacillustequilensis，该菌株已于2017年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13743，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明公开了一株从人参分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)，该菌株已于2017年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc))，保藏编号为cgmccno.13742，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1人参优势芽孢菌种分离、培养及鉴定试验

1.获取人参优势芽孢菌种的材料

2015年8月，在黑龙江省庆安和黑河两地人参种植基地采集人参叶片，选取多株多个叶片。

2.芽孢菌分离方法

人参叶片用消毒剪刀剪切成长度1～2cm的碎片，放入装有50ml无菌生理盐水的锥形瓶中，120rpm振荡1h(使菌体从叶片脱落均匀分散于生理盐水中)，置于63℃保温箱中保温处理4h(63℃维持4h使各种非芽孢菌、霉菌、致病真菌死亡，而芽孢菌基本不死亡)，作为待分离的样本。

制备灭菌cpda培养基制作成培养平板。吸取上述热处理后的样本0.5ml均匀涂布于cpda培养基培养平板，每瓶样本取样10次(涂布10个cpda培养基培养平板)，将涂布好的培养平板置于37℃培养36～48h，培养平板上长出单菌落(每长出1个单菌落认为是一个菌株)。

准备灭菌离心管并用标记笔编号，将1个单菌落分装于2个灭菌离心管中，形成2套样品(1套用于委托菌种鉴定和dna测序分析，另一套本人保存用于后续研究)

3.芽孢菌鉴定方法

对于产芽孢的细菌的鉴定，首先用孔雀绿芽孢染色法鉴定是否为芽孢菌，再用16srdna序列分析技术进一步确定该芽孢菌的种属。

孔雀绿芽孢染色法鉴定操作步骤为：(1)制片：将样本菌株在不利环境条件下培养2～3d，无菌操作下用接种环或解剖针挑取少量菌体样本，反复涂抹于载玻片上，用吹风机吹干1min或自然风干3min。(2)加热染色：向载玻片滴加2滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min。(3)脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。(4)复染：用0.5％番红水溶液复染2min。(5)水洗：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。(6)镜检：将载玻片晾干后用100倍物镜油镜观察，通过观察样本中有一部分菌体内是否是有芽孢存在判定结果，如果观察到一定数量的红色菌体内部出现墨绿色囊状体，则判定为芽孢菌，如果视野中没有任何一个红色菌体内部出现墨绿色囊状体，则判定为非芽孢菌。

4.芽孢菌菌种鉴定方法

根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征及一系列生理生化鉴定试验，具体测定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》及《微生物学实验手册》，进行属和种的鉴定。

5.结果

共从人参叶片培养出260株芽孢菌，其中枯草芽孢杆菌bacillussubtilis87株、特基拉芽孢杆菌b.tequilensis60株、贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis62株、b.licheniformis31株、b.siamensis10株、b.vallismortis5株、b.amyloliquefaciens和b.cereus各两株，staphylococcusequorum和swinemanure各两株。枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌三种菌为优势菌种。

实施例2菌株筛选试验

1.材料

枯草芽孢杆菌bacillussubtilis87株、特基拉芽孢杆菌b.tequilensis60株和贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis62株为申请人从人参叶片中分离所得。人参黑斑病和灰霉病病原菌由沈阳农业大学提供。

2.方法

分别纯培养黑斑病和灰霉病病原菌，培养条件为用cpda琼脂培养基平板置于25℃恒温培养箱培养3～4d，当菌落直径为15～25mm且菌落中央部位明显产生灰黑色气生孢子时作为拮抗实验的接种样本。

分别纯培养枯草芽孢杆菌bacillussubtilis、特基拉芽孢杆菌b.tequilensis、贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis，培养条件为用cpda琼脂培养基平板置于25℃恒温培养箱培养2d，形成肉眼可见的小菌落，再分别接种到装有液体cpda培养基的锥形瓶振荡培养，25℃120r/min摇床上培养36h左右，待培养液中活菌浓度为(1～5)×10⁹个/ml时停止培养，取其中单一菌种或它们的组合物作为后续拮抗实验中作为拮抗实验的接种样本。

制作灭菌cpda琼脂培养皿平板，在每一个培养平板上设置试验组和对照组两个区域，培养平板的左侧接种黑斑病或灰霉病病原菌(作为对照组)，在培养平板的右侧先接种黑斑病或灰霉病的病原菌，再在病原菌接种点的上下左右四个方位间距1cm接种芽孢菌或其组合物，然后置于25℃恒温培养72h，培养至72h时分别测定试验组和对照组黑斑病或灰霉病的病原菌的菌落直径大小(单位：mm)，根据试验组和对照组两个区域病原菌菌落直径的差别判定芽孢菌或其组合物对病原菌的拮抗能力(抑制生长能力)，试验组病原菌菌落直径越小说明芽孢菌或其组合物对病原菌的拮抗能力越强，拮抗效率＝(对照组病原菌菌落直径-试验组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径×100％。

3.结果

在实验室内对三种芽孢杆菌拮抗人参黑斑病和灰霉病的菌株进行筛选，获得具有拮抗三种病原菌的拮抗菌株，分别标号为枯草芽孢杆菌qh5s、特基拉芽孢杆菌qh8t、贝莱斯芽孢杆菌qh6v。以上述三种芽孢杆菌的的纯培养物进行拮抗试验，在cpda培养基平板上做单一菌种分别对人参黑斑病和灰霉病病原菌的拮抗效率，试验结果如下：

枯草芽孢杆菌qh5s对人参黑斑病和灰霉病的拮抗效率分别为52.1％、50.3％；

特基拉芽孢杆菌qh8t对人参黑斑病和灰霉病的拮抗效率分别为51.0％、51.7％；

贝莱斯芽孢杆菌qh6v对人参黑斑病和灰霉病的拮抗效率分别为54.3％、47.3％。

按上述方法将三种芽孢菌按枯草芽孢杆菌：特基拉芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌＝1.5∶1∶1的比例混合配制成复合菌剂，再分别对人参黑斑病和灰霉病病原菌的拮抗效率，拮抗效率为57.9％、55.6％。

实施例3田间实验

1.材料

根据生物入侵的理论，群落种群越复杂，外来物种越不容易入侵。外来物种容易入侵单一种群，而且采用的单一菌种通常也难以长期在叶片上生存，在实际应用中效果不佳，复合菌剂是一种很好的方法。为了保证芽孢菌的稳定定植，根据自然状态下优势菌的比例，采用上述三个拮抗菌比例为：枯草芽孢杆菌：特基拉芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌＝1.5∶1∶1的复合菌剂进行田间试验。

化学杀菌剂为80％代森锰锌可湿性粉剂；50％嘧菌环胺水分散粒剂。

2.方法

田间试验在6月10日黑龙江省清河林业局人参种植基地进行。共设7个处理，即用600-800倍80％代森锰锌可湿性粉剂；50％嘧菌环胺水分散粒剂0.8g/l和复合菌10⁸cfu/ml后叶面喷施。施药方法采用手动喷雾器粗喷雾至人参叶片。每处理设3小区重复，每小区面积为10m²，各处理随机区组排列。小区之间以保护行隔离，试验田按常规管理。

3.结果

在使用药物一个月后，复合菌剂的防治黑斑病的效果与代森锰锌相当，效果优于嘧菌环胺；防治灰霉病的效果优于代森锰锌，与嘧菌环胺相近，复合菌剂对人参两种主要病害具有较好预防作用。7月10日调查结果表明复合菌剂优于代森锰锌和嘧菌环胺，表明复合菌剂药效较长，效果较好。

由于复合菌剂为有益菌，对人和植物无致病作用，使用该制剂又不会带来农药残留，因此是一种防止人参病害的一种很好农药制剂。

复合菌剂的防治效果