本发明涉及一种精液保存方法，具体涉及种牛精液低温保存方法。
背景技术：
精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要的作用，使用冷冻精液可以不受时间、地域和种畜寿命的限制，减少公畜饲养数量，降低生产成本，提高优良畜种的利用率，为畜牧业生产带来巨大的经济效益。同时，精液的冷冻和冷冻精液的使用在畜种引进、血缘更新、疾病控制、濒危品种以及遗传多样性保护上都有极其重要的意义。
牛精液怕热不怕冷，目前，为了降低牛精液的粘度，会采用稀释液对牛精液进行稀释，一般会在30℃以上的温度下对精液进行一次完全稀释，精液在30℃以上的温度下存活时间短，但是，为了保证稀释液与牛精液完全混合并达到目标浓度，需要较长的稀释时间，那么精液在30摄氏度以上的温度下滞留时间长，精液的存活率低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是牛精液在低温保存下，如何保证较高的精子存活率，目的在于提供种牛精液低温保存方法，解决牛精液在低温保存下的存活率的问题。
本发明通过下述技术方案实现：
种牛精液低温保存方法，包括以下步骤：
s1、精液的采集：采集成熟度好的牛精液，存放于2-4℃无菌的环境下备用；
s2、精液的检测：对步骤s1中的精液进行品质检测；
s3、稀释液的配制：制备出具有冷冻精液功能的稀释液；
s4、精液稀释：步骤s3中的稀释液预热后对步骤s2中品质检测达标的精液进行稀释，所述稀释步骤包括以下子步骤：
a、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶0.5对精液进行第一次稀释，精液第一次稀释后降温至15-20℃并平衡1小时；
b、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶1对步骤a中第一次稀释后的精液进行第二次稀释，精液第二次稀释后降温至5-10℃并平衡1小时，所述第二次稀释的稀释液量基于第一次稀释前的精液量；
c、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶1对步骤b中第二次稀释后的精液进行第三次稀释，精液第二次稀释后降温至2-4℃并平衡1小时，所述第三次稀释的稀释液量基于第一次稀释前的精液量；
s5、冷冻保存：将步骤s4中经三次稀释后的精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后抽检并移入液氮罐中进行保存和使用。
本发明分三次进行精液的稀释从而达到目标粘度，每进行一次稀释后均会降低稀释后的牛精液的温度，牛精液在低温下的存活率高，缓慢降低精液的保存温度，有利于提高精子活率，为精子提供了足够的温度适应时间；低温保存主要利用低温来抑制精子活动，降低代谢和能量消耗，抑制微生物生长，同时加入必要营养和其他成分，并隔绝空气，以达到延长精子存活时间的目的；本发明首先优选出了品质较好的精液，保证了进行保存的精液具有较强的存活力，从而有利于在精液稀释时，提高精液中精子的存活率。
步骤s2中品质检测包括以下检测项：精液密度、精子活率、精液酸碱性、精子存活时间。
所述步骤s3中稀释液包括以下组分：超纯水、甘油、大豆卵磷脂、海藻糖、乳糖、维生素e、卵黄、柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷、青霉素。稀释液中须添加如卵黄等抗冷休克物质，提高精子抗冷能力，还需要为精液提供必要的营养物质。
所述步骤a、b、c中稀释液预热到35℃。35℃下既能够保证精液得到快速地稀释，又能够减缓精液迅速死去。
步骤s2检测出的精子活率最低标准值为80％。现有的精液活率一般为70％，本发明在有限的检测手段下选择活率更高的精液，有利于维持低温保存下的精液中精子存活率。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明种牛精液低温保存方法分三次进行精液的稀释从而达到目标粘度，每进行一次稀释后均会降低稀释后的牛精液的温度，牛精液在低温下的存活率高，缓慢降低精液的保存温度，有利于提高精子活率，为精子提供了足够的温度适应时间；
2、本发明种牛精液低温保存方法首先优选出了品质较好的精液，保证了进行保存的精液具有较强的存活力，从而有利于在精液稀释时，提高精液中精子的存活率；
3、本发明种牛精液低温保存方法步骤简单，实用性高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明种牛精液低温保存方法，包括以下步骤：
s1、精液的采集：采集成熟度好的牛精液，存放于2-4℃无菌的环境下备用；
s2、精液的检测：对步骤s1中的精液进行品质检测；
s3、稀释液的配制：制备出具有冷冻精液功能的稀释液；
s4、精液稀释：步骤s3中的稀释液预热后对步骤s2中品质检测达标的精液进行稀释，所述稀释步骤包括以下子步骤：
a、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶0.5对精液进行第一次稀释，精液第一次稀释后降温至15-20℃并平衡1小时；
b、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶1对步骤a中第一次稀释后的精液进行第二次稀释，精液第二次稀释后降温至5-10℃并平衡1小时，所述第二次稀释的稀释液量基于第一次稀释前的精液量；
c、步骤s3中的稀释液预热到30-37℃后，按稀释液∶精液的体积比为1∶1对步骤b中第二次稀释后的精液进行第三次稀释，精液第二次稀释后降温至2-4℃并平衡1小时，所述第三次稀释的稀释液量基于第一次稀释前的精液量；
s5、冷冻保存：将步骤s4中经三次稀释后的精液用程序化冷冻仪进行冷冻，冷冻结束后抽检并移入液氮罐中进行保存和使用。
所述步骤a、b、c中稀释液预热到35℃。35℃下既能够保证精液得到快速地稀释，又能够减缓精液迅速死去。
步骤s2检测出的精子活率最低标准值为80％。现有的精液活率一般为70％，本发明在有限的检测手段下选择活率更高的精液，有利于维持低温保存下的精液中精子存活率。
本发明分三次进行精液的稀释从而达到目标粘度，每进行一次稀释后均会降低稀释后的牛精液的温度，牛精液在低温下的存活率高，缓慢降低精液的保存温度，有利于提高精子活率，为精子提供了足够的温度适应时间；低温保存主要利用低温来抑制精子活动，降低代谢和能量消耗，抑制微生物生长，同时加入必要营养和其他成分，并隔绝空气，以达到延长精子存活时间的目的；本发明首先优选出了品质较好的精液，保证了进行保存的精液具有较强的存活力，从而有利于在精液稀释时，提高精液中精子的存活率。
步骤s2中品质检测包括以下检测项：精液密度、精子活率、精液酸碱性、精子存活时间。
实施例2
基于实施例1，所述步骤s3中稀释液包括以下组分：超纯水、甘油、大豆卵磷脂、海藻糖、乳糖、维生素e、卵黄、柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷、青霉素。稀释液中须添加如卵黄等抗冷休克物质，提高精子抗冷能力，还需要为精液提供必要的营养物质。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。