一种含抗冻蛋白的细胞冻存液的制作方法

本发明涉及细胞冻存液领域，具体涉及一种含抗冻蛋白的细胞冻存液。

背景技术：

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

在超低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用冷冻保护剂。二甲基亚砜(dmso)是一种重要的渗透型细胞保护剂，dmso能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，是目前常用细胞冻存液的主要成分。但dmso是有人体和细胞毒性的，并能使细胞产生形态分化。研究表明培养液中dmso浓度为10％时,细胞生长抑制率近100％；1‰浓度时抑制率为35％；即使是0.04‰的浓度,dmso对细胞的生长也有不利的影响。培养液中残存的dmso是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因。

技术实现要素：

本发明的目的一种不含dmso的细胞冻存液。使用抗冻蛋白afp134替代dmso，以提高细胞复苏率，降低细胞毒性，保护细胞株的原始特性。

发明内容如下：

一种细胞冻存液，其组分包括：afp134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬酸钠、灭菌双蒸水。

进一步的，afp134抗冻蛋白终浓度为0.01mg/ml，小牛血清终浓度为90％，蔗糖终浓度0.5m/l，柠檬酸钠终浓度为0.05m/l。

进一步的，afp134抗冻蛋白质量浓度为0.5g/l-2g/l，蔗糖质量浓度为10g/l-20g/l，柠檬酸钠质量浓度为1g/l-3g/l，小牛血清的体积分数为70％-95％。

一种细胞冻存液的应用，包括如下步骤：

a、细胞冻存

(1)取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗；

(2)去除pbs，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；

(3)离心1000rpm，离心5min；

(4)去除胰蛋白酶，加入配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×10⁶/ml～1×10⁷/ml；

(5)将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；

(6)冻存：降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中；也可将装有细胞的冻存管放入-20℃保存2h，然后放入-70℃冰箱中保存12h，取出冻存管，移入液氮容器内；b、细胞复苏

(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中

(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

(3)离心，转速1000rpm，时间为5min；

(4)弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

(5)次日更换一次培养液，继续培养。

抗冻蛋白(antifreezeprotein，afp)具有阻止冰晶形成的功能。afp134具有冰晶亲和力，能够降低冰晶形成温度，而不影响溶解温度，此外，afp134利用自身冰晶亲和面与冰晶结合，从而阻止或抑制冰晶的生长。afp134还能能够阻止冰的再结晶，从而避免细胞受到由冰晶导致的机械性损伤。本发明所述的细胞抗冻液需在-20℃保存，保质期一年。

附图说明：

图1是使用本发明细胞冻存液冻存细胞复苏效果；

图2是使用不含afp134和dmso的对照溶液冻存后的复苏效果。

具体实施方式：

(一)冻存液配制：

称取afp134(终浓度0.01mg/ml)1mg、小牛血清(终浓度90％)90ml、蔗糖(终浓度0.5m/l)17g、柠檬酸钠(终浓度0.05m/l)1.47g

将上述物质加入到90ml灭菌双蒸水中，定容至100ml

(二)细胞冻存

1.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。

2.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；

3.离心1000rpm，5min；

4.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×10⁶/ml；

5.将细胞分装入冻存管中，每管1.2ml；

6.冻存：冻存程序为降温速率--2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-8℃/min；到-100℃时，则迅速浸入液氮中。

(三)细胞复苏

1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加12倍培养液，混匀；

3.离心，1000rpm，5min；

4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5.次日更换一次培养液，继续培养。

附图说明：图1是使用本发明细胞冻存液冻存细胞复苏效果，图2是使用不含afp134和dmso的对照溶液冻存后的复苏效果。

由图1、图2对比可知，采用本发明的细胞冻存液冻存细胞，细胞复苏率高，能保持细胞株的原始特性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、改进、替换等，应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
该发明涉及细胞冷冻液领域，具体涉及一种含抗冻蛋白的细胞冻存液。本发明在细胞冷冻液中添加AFP134蛋白，可有效的提高细胞复苏率，不含DMSO，降低DMSO对细胞毒性影响。

技术研发人员：王燕;奎翔;易晓佳
受保护的技术使用者：昆明医科大学第二附属医院
技术研发日：2017.07.25
技术公布日：2017.11.10