【
技术领域：
】本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，具体涉及一种斑舌兰的组培快繁方法。
背景技术：
：斑舌兰是兰花的一种，因其独特的花朵形态而得名,是兰花中的名品。斑舌兰的萼片与花瓣黄绿色，略有红褐色晕，基部有紫褐色斑点，唇瓣白色，授粉后变为粉红色；花瓣略短于萼片；唇瓣近倒卵形，3裂。作为国家重点保护植物，是家庭养殖中最难得的兰花品种。但因其高洁的文化品格,让文人雅士对其青睐有加。长期以来，斑舌兰以分株繁殖为主，但繁殖速度慢。想要在短时间内得到更多的植株，可以利用组织培养的方式繁殖，国内对斑舌兰进行组培繁殖的报道很少。目前，也有一些学者研究了采用斑舌兰茎尖做外植体进行组织培养得到斑舌兰苗的方法，但斑舌兰茎尖容易染菌，且其茎尖幼嫩，对化学消毒剂敏感，容易受到伤害，导致培养过程中增殖率和分化率低；另外，由于相关的研究较少，没有找到更适合茎尖分化组织生长的培养基，导致组织培养过程中，培养周期长，培养成效不尽人意。技术实现要素：本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种斑舌兰的组培快繁方法，本发明的方法对外植体的伤害小，且采用本发明提供的培养基配方可显著提高斑舌兰的诱导分化率、外植体增殖系数及生根率，缩短培养周期，提高斑舌兰组培苗的质量。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种斑舌兰的组培快繁方法，包括外植体的消毒、诱导培养、继代培养及壮苗培养，具体步骤为：(1)外植体的消毒：采集长度为5-7cm的斑舌兰假鳞茎作为外植体，首先用流水冲洗，再用体积浓度为75％的酒精浸泡1-2min后剥去表面部分叶片，接着在植物消毒液中浸泡8min-15min后继续剥去部分叶片，随后在所述植物消毒液中继续浸泡5-10min，用无菌水冲洗2-4次，最后移入超净工作台内，在解剖镜下剥去剩下的叶片，露出生长点，用解剖刀切取0.5-2mm大小的茎尖分生组织；所述植物消毒液由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.05-0.08份，仙人掌汁8-10份，栀子提取物0.2-0.4份，吐温-602-4份，水75-100份；(2)诱导培养：将所述茎尖分生组织接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃的条件下暗培养10-12天，然后移至光照照度为1500lx的室内，每天光照10-14h的培养40-45天，得斑舌兰原球茎；所述诱导培养基的组成为：ls培养基+玉米素0.5mg/l-0.8mg/l+ggr0.1mg/l-0.2mg/l+琼脂5.0g/l-8.0g/l+蔗糖2.0g/l-4.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l-12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l-15.0g/l，ph值5.2-5.3；(3)继代培养：将步骤(2)中生长得到的斑舌兰原球茎转接入继代培养基内，在温度为25±1℃，光照为1500lx，每天光照10-14h的条件下培养，随着原球茎的生长不断更换培养基，继代培养75-85天后，分化得到大量不定芽；(4)壮苗培养：将斑舌兰幼株转接到壮苗培养基中，培养至根数为3-5条，叶片3-4片，苗高4-8cm，即得到生根试管苗；(5)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗5-7天，打开瓶盖再炼苗2-3天，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70-80％。本发明中，优选地，所述继代培养基的组成为：ls培养基+活性炭1g/l+赤霉素0.8mg/l-1.0mg/l+ggr0.4mg/l-0.6mg/l+琼脂5.0g/l-8.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l-12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l-15.0g/l+蔗糖2.0g/l-4.0g/l，ph值5.2-5.3。本发明中，优选地，所述壮苗培养基的组成为：1/3ms+活性炭1g/l+吲哚丁酸0.8mg/l-1.0mg/l+萘乙酸0.3mg/l-0.5mg/l+琼脂5.0g/l-8.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l-12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l-15.0g/l+蔗糖2.0g/l-4.0g/l，ph值5.4-5.6。本发明中，优选地，栀子提取物是通过以下方法得到的：首先将栀子果实洗净去杂，在真空条件下干燥后，将栀子粉碎，得栀子粉；将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95-99:1-5研磨至200-300目，得混合微粉；将混合微粉和体积分数为50-65％的乙醇按料液比1g：20-30ml回流提取2-6次，合并滤液，浓缩、干燥得栀子醇提物；以乙腈-氯仿体积比为3-4：1的混合液为提取剂，向所述栀子醇提物中加入提取剂，提取2-5次，合并提取液，回收所述提取剂得到栀子提取物。本发明中，优选地，所述辣木叶汁的制备方法是：先洗净原料，然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即辣木叶汁。本发明中，优选地，所述仙人掌汁是将仙人掌除去表皮后，用机器搅打成汁得到的；所述黄秋葵汁是将黄秋葵表皮洗净后，用机器搅打成汁得到的。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：(1)本发明以斑舌兰的假鳞茎作为外植体，对其进行消毒时主要采用植物消毒剂进行浸泡，该植物消毒剂是由乙酰紫草素、仙人掌汁、栀子提取物加乳化剂吐温-60和水混合制成的；其中仙人掌汁和栀子均具有良好的杀菌抗病毒的作用，但两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足外植体消毒的需要，经本申请人反复试验后发现加入少量的乙酰紫草素配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果；采用该植物消毒液可以大大降低外植体的损伤率和降低接种的污染率。(2)本发明采用的培养基中添加了辣木叶汁和黄秋葵汁作为营养物质，辣木叶中含有多种矿物质、维生素、20种氨基酸、46种抗氧素和36种自然防炎体和矿物质，每100克的辣木中含有的维生素c是柑橘的7倍，铁是菠菜的3倍，维生素a是胡萝卜的4倍，钙质是牛奶的4倍，钾是香蕉的3倍，蛋白质是酸奶的2倍；黄秋葵的营养丰富，幼果中含有大量的粘滑汁液，具有特殊的香味；其汁液中混有果胶，牛乳聚糖及阿拉聚糖等；它的果胶为可溶性纤维，在现代保健新观念中极为重视；凡经常食用它有健胃肠，滋补阴阳之功效；据测定每百克嫩果中含蛋白质2.5克、脂肪0.1克、糖类2.7克，纤维素a660国际单位；维生素b1，0.2毫克、维生素b20.06毫克、维生素44毫克、钙81毫克、磷63毫克、铁0.8毫克。这两种物质的联合添加，与生长调节剂、基础培养基一起作用，可以显著提高斑舌兰的诱导分化率、外植体增殖系数及生根率，缩短培养周期，并提高斑舌兰组培苗的质量。(3)本发明中栀子提取物在制备过程中，采用的提取方法是先醇提，然后用乙腈-氯仿的混合剂进行提取，可以针对性地得到栀子中的抗菌活性成份，得到的提取物抗菌活性较好。【具体实施方式】为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。在本发明的实施例中，辣木叶汁、黄秋葵汁和仙人掌汁的制备方法如下：辣木叶汁：先洗净叶片然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。黄秋葵汁：先洗净叶片然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为黄秋葵汁。仙人掌汁：先将仙人掌除去表皮后，用机器搅打成汁即得。在本发明的一些实施例中，栀子提取物通过以下方法得到：首先将栀子果实洗净去杂，在真空条件下干燥后，将栀子粉碎，得栀子粉；将栀子粉和氢氧化钙按重量比为95:1研磨至200目，得混合微粉；将混合微粉和体积分数为50％的乙醇按料液比1g：20ml回流提取2次，合并滤液，浓缩、干燥得栀子醇提物；以乙腈-氯仿体积比为3：1的混合液为提取剂，向所述栀子醇提物中加入提取剂，提取2次，合并提取液，回收所述提取剂得到栀子提取物。在本发明的另一些实施例中，栀子提取物通过以下方法得到：首先将栀子果实洗净去杂，在真空条件下干燥后，将栀子粉碎，得栀子粉；将栀子粉和氢氧化钙按重量比为99:5研磨至300目，得混合微粉；将混合微粉和体积分数为65％的乙醇按料液比1g：30ml回流提取6次，合并滤液，浓缩、干燥得栀子醇提物；以乙腈-氯仿体积比为4：1的混合液为提取剂，向所述栀子醇提物中加入提取剂，提取5次，合并提取液，回收所述提取剂得到栀子提取物。上述方法得到的栀子提取物的抗菌活性没有显著的差异，故在以下实施例中，不通过具体实施例进行赘述。实施例1一种斑舌兰的组培快繁方法，包括外植体的消毒、诱导培养、继代培养及壮苗培养，具体步骤为：(1)外植体的消毒：采集长度为5-7cm的斑舌兰假鳞茎作为外植体，首先用流水冲洗，再用体积浓度为75％的酒精浸泡1min后剥去表面部分叶片，接着在植物消毒液中浸泡8min后继续剥去部分叶片，随后在所述植物消毒液中继续浸泡5min，用无菌水冲洗2次，最后移入超净工作台内，在解剖镜下剥去剩下的叶片，露出生长点，用解剖刀切取0.5-2mm大小的茎尖分生组织；植物消毒液由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.05份，仙人掌汁8份，栀子提取物0.2份，吐温-602份，水75份；(2)诱导培养：将所述茎尖分生组织接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃的条件下暗培养10天，然后移至光照照度为1500lx的室内，每天光照10h的培养40天，得斑舌兰原球茎；所述诱导培养基的组成为：ls培养基+玉米素0.5mg/l+ggr0.1mg/l+琼脂5.0g/l+蔗糖2.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l+辣木叶汁15.0g/l，ph值5.2；(3)继代培养：将步骤(2)中生长得到的斑舌兰原球茎转接入继代培养基内，继代培养基的组成为：ls培养基+活性炭1g/l+赤霉素0.8mg/l+ggr0.4mg/l+琼脂5.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l+辣木叶汁15.0g/l+蔗糖2.0g/l，ph值5.2。在温度为25±1℃，光照为1500lx，每天光照10h的条件下培养，随着原球茎的生长不断更换培养基，继代培养85天后，分化得到大量不定芽；(4)壮苗培养：将斑舌兰幼株转接到壮苗培养基中，壮苗培养基的组成为：1/3ms+活性炭1g/l+吲哚丁酸0.8mg/l+萘乙酸0.3mg/l+琼脂5.0g/l+黄秋葵汁8.0g/l+辣木叶汁15.0g/l+蔗糖2.0g/l，ph值5.4。培养至根数为3-5条，叶片3-4片，苗高4-8cm，即得到生根试管苗；(5)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗5天，打开瓶盖再炼苗2天，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70-80％。实施例2一种斑舌兰的组培快繁方法，包括外植体的消毒、诱导培养、继代培养及壮苗培养，具体步骤为：(1)外植体的消毒：采集长度为5-7cm的斑舌兰假鳞茎作为外植体，首先用流水冲洗，再用体积浓度为75％的酒精浸泡1.5min后剥去表面部分叶片，接着在植物消毒液中浸泡12min后继续剥去部分叶片，随后在所述植物消毒液中继续浸泡8min，用无菌水冲洗3次，最后移入超净工作台内，在解剖镜下剥去剩下的叶片，露出生长点，用解剖刀切取0.5-2mm大小的茎尖分生组织；所述植物消毒液由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.06份，仙人掌汁9份，栀子提取物0.3份，吐温-603份，水90份；(2)诱导培养：将所述茎尖分生组织接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃的条件下暗培养11天，然后移至光照照度为1500lx的室内，每天光照12h的培养40天，得斑舌兰原球茎；所述诱导培养基的组成为：ls培养基+玉米素0.6mg/l+ggr0.15mg/l+琼脂6.0g/l+蔗糖3.0g/l+黄秋葵汁10.0g/l+辣木叶汁13.0g/l，ph值5.2；(3)继代培养：将步骤(2)中生长得到的斑舌兰原球茎转接入继代培养基内，继代培养基的组成为：ls培养基+活性炭1g/l+赤霉素0.9mg/l+ggr0.5mg/l+琼脂6.0g/l+黄秋葵汁10.0g/l+辣木叶汁14.0g/l+蔗糖3.0g/l，ph值5.3。在温度为25±1℃，光照为1500lx，每天光照12h的条件下培养，随着原球茎的生长不断更换培养基，继代培养75天后，分化得到大量不定芽；(4)壮苗培养：将斑舌兰幼株转接到壮苗培养基中，壮苗培养基的组成为：1/3ms+活性炭1g/l+吲哚丁酸0.9mg/l+萘乙酸0.4mg/l+琼脂6.0g/l+黄秋葵汁10.0g/l+辣木叶汁14.0g/l+蔗糖3.0g/l，ph值5.6。培养至根数为3-5条，叶片3-4片，苗高4-8cm，即得到生根试管苗；(5)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗6天，打开瓶盖再炼苗2天，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70-80％。实施例3一种斑舌兰的组培快繁方法，包括外植体的消毒、诱导培养、继代培养及壮苗培养，具体步骤为：(1)外植体的消毒：采集长度为5-7cm的斑舌兰假鳞茎作为外植体，首先用流水冲洗，再用体积浓度为75％的酒精浸泡2min后剥去表面部分叶片，接着在植物消毒液中浸泡15min后继续剥去部分叶片，随后在所述植物消毒液中继续浸泡10min，用无菌水冲洗4次，最后移入超净工作台内，在解剖镜下剥去剩下的叶片，露出生长点，用解剖刀切取0.5-2mm大小的茎尖分生组织；所述植物消毒液由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.08份，仙人掌汁10份，栀子提取物0.4份，吐温-604份，水100份；(2)诱导培养：将所述茎尖分生组织接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃的条件下暗培养12天，然后移至光照照度为1500lx的室内，每天光照14h的培养40天，得斑舌兰原球茎；所述诱导培养基的组成为：ls培养基+玉米素0.8mg/l+ggr0.2mg/l+琼脂8.0g/l+蔗糖4.0g/l+黄秋葵汁12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l，ph值5.3；(3)继代培养：将步骤(2)中生长得到的斑舌兰原球茎转接入继代培养基内，继代培养基的组成为：ls培养基+活性炭1g/l+赤霉素1.0mg/l+ggr0.6mg/l+琼脂8.0g/l+黄秋葵汁12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l+蔗糖3.0g/l，ph值5.3。在温度为25±1℃，光照为1500lx，每天光照14h的条件下培养，随着原球茎的生长不断更换培养基，继代培养80天后，分化得到大量不定芽；(4)壮苗培养：将斑舌兰幼株转接到壮苗培养基中，壮苗培养基的组成为：1/3ms+活性炭1g/l+吲哚丁酸1.0mg/l+萘乙酸0.5mg/l+琼脂8.0g/l+黄秋葵汁12.0g/l+辣木叶汁12.0g/l+蔗糖4.0g/l，ph值5.6。培养至根数为3-5条，叶片3-4片，苗高4-8cm，即得到生根试管苗；(5)试管苗的移栽：将生根试管苗带瓶盖置于常温条件下炼苗7天，打开瓶盖再炼苗3天，将生根试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去基部残留的培养基，移栽于以苔藓为基质的穴盘，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70-80％。对比例1采用质量浓度为0.1％的次氯酸钠代替植物消毒液进行消毒，其他条件与实施例2相同，考察消毒方式对诱导分化率、外植体增殖系数及生根率的影响。对比例2采用的植物消毒液与实施例2不同，不添加甘草酸，具体为：仙人掌汁9份，栀子提取物0.3份，吐温-603份，水90份。对比例3采用椰汁代替辣木汁和黄秋葵汁，其他条件与实施例2相同，即诱导培养基的组成为：ls培养基+玉米素0.6mg/l+ggr0.15mg/l+琼脂6.0g/l+蔗糖3.0g/l+椰汁100g/l，ph值5.2；继代培养基的组成为：ls培养基+活性炭1g/l+赤霉素0.9mg/l+ggr0.5mg/l+琼脂6.0g/l+椰汁100g/l+蔗糖3.0g/l，ph值5.3；壮苗培养基的组成为：1/3ms+活性炭1g/l+吲哚丁酸0.9mg/l+萘乙酸0.4mg/l+琼脂6.0g/l+椰汁100g/l+蔗糖3.0g/l，ph值5.6；采用实施例2相同的方法培养斑舌兰苗，培养过程中统计诱导分化率、外植体增殖系数及生根率。对比例4与实施例2中采用的培养基不同，具体培养基为：诱导培养基的组成为：ms+活性炭1g/l+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+琼脂6g/l+蔗糖30g/l；继代培养基的组成为：1/2ms+活性炭1g/l+6-ba0.8mg/l+naa0.5mg/l+琼脂6g/l+蔗糖30g/l；壮苗培养基的组成为：1/2ms+活性炭1g/l+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+琼脂6g/l+蔗糖30g/l。采用实施例2相同的方法培养斑舌兰苗，培养过程中统计诱导分化率、外植体增殖系数及生根率。组培试验方法及结果：每组取200个外植体样本，分别采用实施例1-3以及对比例1-4的方法进行组培，试验过程中，统计各组的染菌情况、增殖情况、分化生根情况，考察各因素对斑舌兰组培的影响。1、外植体接种后的染菌情况：在诱导培养10天后，统计各组的染菌数量，其结果如下表1：表1实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3对比例4染菌数33563254从表1的结果可以看出，采用本发明的植物消毒液，斑舌兰外植体的染菌情况比采用常规的次氯酸消毒稍好。在添加乙酰紫草素后，染菌数相比对比例2低很多，说明乙酰紫草素的添加与仙人掌汁和栀子提取物起到了协同作用。2、组培过程中的生长情况：将斑舌兰的外植体诱导培养60天后，统计各组外植体的分化增殖情况，将诱导培养的原球茎继代培养80天后，统计平均芽分化率和平均生根率；继续壮苗培养30天后统计平均根长，各组的结果如表2所示。表2从表2的结果可以看出，实施例1-3的平均茎长、增殖系数、平均芽分化率、平均生根率、平均根长均好于对比例1，说明由于消毒方式的改变，虽然对染菌数的控制与现有技术相当，但是采用本发明的方式，不伤害外植体，组培过程中，各个阶段的生长情况都相对较好。相对于对比例3，实施例1-3的平均茎长、增殖系数平均芽分化率、平均生根率、平均根长均明显较好，说明相较添加椰汁，采用辣木叶汁和黄秋葵汁相配合作为营养剂，使培养基的组成更适合斑舌兰外植体的生长。相对于对比例4，实施例3因为采用的培养基不同，各个阶段的生长情况也明显较好。另外，后续的种植试验表明实施例1-3中的组培苗种植成活率可达95％以上。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12