本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种诱导多功能干细胞冻存液以及诱导多功能干细胞冻存方法。
背景技术：
诱导的多能干细胞是指将分化的体细胞重编程而获得的多潜能干细胞，具有自我更新及多向分化的潜能，它在干细胞蛋白标记基因和蛋白表达水平、畸胎瘤形成、自我更新潜能和多向分化能力等许多方面类似于胚胎干细胞。诱导多功能干细胞不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等诸多方面的限制，在药物开发、疾病治疗和机理研究方面极具应用价值，是当前全球干细胞研究的热点。
由于多功能干细胞的获得是时间和劳动密集型，而且干细胞的细胞表型会受到传代次数的影响，故在研究过程中经常会涉及到干细胞的冻存。在冻存过程中会显著改变多功能干细胞的热力学、化学和物理环境，对细胞造成损伤，冻存不当甚至会导致细胞死亡。
冻存过程中的影响因素有：细胞浓度、冷冻速率和冻存液。以较高的细胞浓度进行冻存，细胞的存活率更高，冻存速率是以1℃/min的速率进行冻存效果最佳。目前最常用的干细胞冻存液为90％胎牛血清(FBS)+10％二甲基亚砜(DMSO)，或者50％干细胞完全培养基+40％FBS+10％DMSO。DMSO虽然对细胞的穿透力较强，可以降低细胞的冰点，减少冰晶的形成，在降温的过程中能对细胞达到保护作用。但是高浓度二甲基亚砜具有毒性，可以与细胞内蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，造成细胞损伤或者失活。而且现有的冻存液由于使用动物源的血清导致细胞冻存液中参入非人员物质，会对多功能干细胞造成残留或者污染。
为获得无动物源污染、数量大的诱导多功能干细胞，并建立多功能干细胞库，研究开发出一种无动物外源成分、对细胞损伤较小并能够长久保存多功能干细胞的冻存液及冻存方法，对诱导多功能干细胞的研究具有重要意义。
技术实现要素：
为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明领域的普通技术人员通常理解的含义。
除非另外说明，本文中的iPSCs为诱导多功能干细胞的英文简称，DMSO为二甲基亚砜的英文简称，KSR为血清替代品的英文简称，DMEM为基础培养基的英文简称。
除非另外说明，本文中的多功能干细胞和细胞均指诱导多功能干细胞。
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、无动物外源成分、细胞存活率更高的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法。
本发明的一个目的是提供一种诱导多功能干细胞的冻存液。
本发明所述的冻存液由A液和B液组成。A液与B液的体积比为1:1。
所述的A液100mL中含有0-3％β-巯基乙醇、0-5％白血病抑制因子、0-4％的NEAA、0-4％的L-谷氨酰胺、0-5μM CHIR99021、0-5μM PD0325901、38-55％的KSR和40-58％的DMEM。
优选地，所述的A液100mL中含有0.5-2％β-巯基乙醇、0.5-2％白血病抑制因子、0.3-3％的NEAA、0.3-3％的L-谷氨酰胺、1-4μM CHIR99021、1-4μM PD0325901、40-50％的KSR和45-55％的DMEM。
更优选地，所述的A液100mL中含有0.8％β-巯基乙醇、0.8％白血病抑制因子、1％的NEAA、1％的L-谷氨酰胺、2μM CHIR99021、1μM PD0325901、45％的KSR和51.4％的DMEM。
所述的B液100mL中含有6-12％KSR、0-3.5％的NEAA、0-3.5％的L-谷氨酰胺、0.5-1.5％β-巯基乙醇、1-2％白血病抑制因子、2-5μM CHIR99021、0.1-1μM PD0325901、7-15％的DMSO、6-15％的羟乙基淀粉和55-68％的DMEM。
优选地，所述的B液100mL中含有8-11％KSR、1-3％的NEAA、1-3％的L-谷氨酰胺、0.8-1.2％β-巯基乙醇、1.5-1.8％白血病抑制因子、2.5-3μM CHIR99021、0.5-0.8μM PD0325901、8-13％的DMSO、8-13％的羟乙基淀粉和60-65％的DMEM。
更优选地，所述的B液100mL中含有10％KSR、2％的NEAA、2％的L-谷氨酰胺、1％β-巯基乙醇、1.6％白血病抑制因子、3μM CHIR99021、0.6μM PD0325901、10％的DMSO、10％的羟乙基淀粉和63.4％的DMEM。
本发明另一个目的是提供一种诱导多功能干细胞的冻存方法，该方法包括以下步骤：a.将消化的多功能干细胞离心后后加入适量A液。b.加入等量B液混匀。c.将干细胞与冻存液的混合液放于程序降温盒中冷冻，24小时后将冷冻的细胞悬液转移到液氮中。
优选地，所述的细胞悬液终浓度为1×106-6×106个/mL。
本发明的冻存液成分明确，不含有动物血清，避免了动物源性污染。KSR代替了动物血清，无动物外源性成分，整个配方组成清晰，更加安全，对于多功能干细胞的进一步研究不会造成干扰。KSR中的β-巯基乙醇和成纤维细胞生长因子，以及B液中的DMSO和羟乙基淀粉在冻存的过程中可以增加细胞的通透性，并且可以在冻存过程中保护细胞，降低细胞的冰点，减少冰晶的产生，从而保持细胞活力，防止多功能干细胞出现分化。
与现有的技术方案相比，本发明的有益效果：第一，本发明的冻存液不含有动物血清，对干细胞无外源性动物成分污染。第二，本发明减少了DMSO的用量，降低了冻存液中高浓度DMSO对细胞的损伤，从而保持细胞活性，有效防止细胞分化。第三，本发明的冻存液可于4℃保存，不需要反复冻融和现配现用。第四，本发明的冻存方法操作简便，节约人力。
附图说明
为了清晰地阐明本发明的具体实施方式，提供了以下附图，用以描述本发明的一些实施方式。
图1显示多功能干细胞复苏1天后的细胞形态图。
图2显示本发明所述冻存液及冻存方法冻存的细胞以及常规的冻存液冻存的细胞复苏后克隆的生长情况。
图3显示本发明所述冻存液及冻存方法冻存的细胞以及常规的冻存液冻存的细胞复苏后测定的生长曲线。
图4显示多功能干细胞复苏以后碱性磷酸酶检测图。
图5表示多功能干细胞免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、诱导多功能干细胞冻存液的配制
冻存液由A液和B液组成。A液与B液的体积比为1:1。
每100mL冻存液A液中含有以下组分：
每100mL冻存液B液中含有以下组分：
配制方法:将各成分混匀后分别得到A液和B液，4℃保存。
实施例2、冻存液在冻存诱导多功能干细胞中的应用
冻存方法：
将处于对数生长期的诱导多功能干细胞消化后，800rpm/min离心5分钟后去上清，用适量本发明的A液进行重悬，进行细胞计数后，加入等量的B液，使细胞浓度为1×106-6×106个/mL，然后1mL/管的量分装于1.8mL的细胞冻存管中，放于程序降温盒内置于-80℃进行程序降温，24小时后转入液氮中进行保存。
冻存结果检验：
1、多功能干细胞复苏后形态观察
冻存后的细胞复苏后每天换液，在显微镜下进行形态观察，待形成克隆后拍照。复苏后的多功能干细胞形态如图1所示，可见多功能干细胞克隆呈圆形，边缘清晰，克隆边缘无分化的细胞爬出。说明本发明的冻存液在冻存过程中能有效保护细胞活性。防止细胞分化。
2、多功能干细胞复苏后的生长情况对比
将本发明的冻存液和常规冻存液在相同条件下冻存一批同代次诱导多功能干细胞，半年后复苏细胞，并观测形成克隆的形态变化，结果如图2所示。由图2结果可见，本发明的冻存液冻存的多功能细胞复苏后，克隆生长的速度要快于常规冻存液冻存的细胞，且克隆边界清晰。其中常规冻存液为含有10％的DMSO和90％FBS。
3、多功能干细胞复苏后的生长曲线测定
将本发明的冻存液和常规冻存液冻存的同一批次的细胞复苏，计数后以1×104/mL的密度1mL铺于6孔板一孔中，每种冻存液冻存的细胞铺35孔。之后每隔24h取3个孔消化计数，取其平均数，直到细胞经过平台期开始死亡。细胞生长曲线如图3所示，从图中可以看出，本发明的冻存液冻存的细胞复苏后经过3天的滞留期即进入了对数生长期，在第7天达到平台期，且细胞密度能达到1×106/mL。相对比本发明的冻存液冻存的细胞，使用常规冻存液冻存的细胞复苏后滞留期较长，到第9天才进入平台期，且最终细胞密度要低于1×106/mL，说明本发明冻存液冻存细胞的细胞活力要强于常规冻存液冻存的细胞。
4、多功能干细胞复苏后进行碱性磷酸酶检测
将本发明的冻存液冻存的多功能干细胞复苏，待克隆长到直径100μm左右进行碱性磷酸酶检测。先用多聚甲醛固定细胞后加入足量的碱性磷酸酶染色液，于37℃恒温箱中避光孵育0.5-2h。用PBS洗涤，最后加入适量PBS在显微镜下观察染色结果并拍照，碱性磷酸酶染色的结果如图4所示。由图4可见，克隆边界清晰，且全部被染为蓝紫色，说明冻存液保护了细胞活力，有效防止了细胞分化。
5、多功能干细胞复苏后进行免疫荧光鉴定
将本发明的冻存液冻存的多功能干细胞复苏，待克隆长到直径100μm左右进行免疫荧光鉴定。固定细胞后进行通透，再分别加入荧光一抗和荧光二抗，加入防荧光淬灭剂后在荧光显微镜下采集图像，结果如图5所示。由图4可知，克隆表达了多能性细胞的标记基因，说明在冻存过程中，细胞没有分化，并且具备多向分化的潜能。
结论：用本发明的诱导多功能干细胞冻存液以及冻存方法冻存的干细胞，复苏后干细胞能迅速增殖、具有很好的活性并表达多功能干细胞的标记基因。
综上所述，本发明的冻存液及冻存方法可以使诱导多功能干细胞在液氮下长期保存，并能保持细胞活性，防止细胞分化，对促进诱导多功能干细胞研究、建立诱导多功能干细胞库具有重大意义。
需要说明的是，上述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，并不以任何形式限制本发明，凡根据本发明的技术方案等同替换或改变获得的技术方案，均涵盖在本发明的保护范围内。