一种快速高效获取木棉组培苗的方法与流程

本发明涉及一种快速高效获取木棉组培苗的方法，属于植物组织培养领域。

背景技术：

木棉（bombaxceiba.l）为木棉科（bombacaceae）木棉属（bombax）植物，是热带、南亚热带典型的指示性植物，广泛分布于我国的云南、贵州、广西、广东等省亚热带地区。木棉的花大而美，树姿巍峨，可植为园庭观赏树，行道树。木棉全身都是宝，其纤维、木材、花、皮、叶、根、种籽等均可利用，且一次栽植能够连续收获100~300年，有着广泛的工业、药用、食用、观赏价值。同时其优良的逆境生存能力，对干热河谷地区植被恢复具有重要的生态价值，在干热河谷的引种将达到生态、经济和社会效益的有效统一。

目前木棉的繁殖育苗主要采用传统种子育苗或者扦插扩繁，然而由于气候和自身生理因素，木棉的种子发芽率不高，扦插成活率低。而且传统木棉育苗方法易受季节和地理位置等因素的影响，育苗效率极其低下，并且使用传统种子育苗很难保持母本的优良性状。已有大量的文献表明植物组培可以作为植物繁殖育苗的方法。但是到目前为止还没有关于木棉组培苗获取的相关报道，更没有如何快速高效获取木棉组培苗的技术。

技术实现要素：

本发明提供一种快速高效获取木棉组培苗的方法，旨在提供一种能够加速获得木棉组培苗的操作流程与培养技术，为木棉的规模化繁育提供一种新的技术平台。

本发明提供一种快速高效获取木棉组培苗的方法，是通过获取能够快速形成愈伤组织的外植体，经过无菌处理；木棉愈伤组织的诱导培养；木棉愈伤组织增殖培养；木棉胚性愈伤组织锻炼培养；木棉胚性愈伤组织芽分化培养获得小苗和新的愈伤组织，再将小苗进行生根培养；愈伤组织进行增殖培养和胚性愈伤组织锻炼培养再形成胚性愈伤组织，周而复始，从而获得大量组培苗。

a.所述的获取能够快速形成愈伤组织的外植体，是将木棉种子用10%的过氧化氢表面消毒10min，埋入装有高压蒸汽灭菌2h的河沙的磁盘中，置于22~26℃，湿度65~75%，光照3000lux，光照时间12h培养箱中培养育苗，待木棉种子长成5~8cm高的幼苗，去除幼苗的根和叶获得的木棉苗的幼茎作为外植体；

b.所述的无菌处理，是指将去除根和叶的木棉幼苗茎段放入无菌蒸馏水中浸泡20~35min，然后用75%的乙醇消毒30s，再用0.1%hgcl2消毒5~8min，用无菌蒸馏水冲洗5遍去除木棉苗表面的消毒液，再用无菌滤纸吸干外植体上多余的水分；

c.所述的木棉愈伤组织的诱导培养，是将木棉幼苗茎段用解剖刀切成长0.3~0.6cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基，每个培养皿3~8个，置于22~26℃，湿度65~75%的培养箱中暗培养10~21d脱分化成愈伤组织，愈伤组织诱导培养基的具体参数为：ms+2mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+5g/l葡萄糖+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

d.所述的愈伤组织增殖培养，是将愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基，每皿接种3~8个切成直径为0.2~0.5cm的愈伤组织小块，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，10~15d后，愈伤组织长至0.7~1.5cm的淡黄色球状体，其愈伤组织增殖培养基具体参数是：ms+0.5mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+5g/l葡萄糖+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

e.所述的木棉胚性愈伤组织锻炼培养，是将扩繁的愈伤组织块切成直径为0.4~0.7cm的愈伤组织小块，接入胚性愈伤组织锻炼培养基，每皿3~8个培养，置于温度为22~26℃，湿度为50~60%，光照2000lux，光照时间12h/d的培养箱中继续培养8~14d，获得胚性愈伤组织，其胚性愈伤组织锻炼培养基具体参数是：1/4ms+0.1mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+20g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8-6.0；

f.所述的木棉胚性愈伤组织芽分化培养，是将胚性愈伤组织接入诱芽培养基培养，温度为22~26℃，湿度为55~65%，光照3000lux，光照时间12h/d培养箱中培养，获得芽和愈伤组织，其诱芽培养基具体参数为：ms+0.1mg/lnaa+1mg/l6-ba+20g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

g.所述的生根培养，是将芽基部的愈伤组织切下放入新的愈伤组织增殖培养基中进行新一轮的增殖培养和胚性愈伤组织锻炼培养，将芽接入装有诱根培养基培的三角瓶中，置于温度为22~26℃，湿度为50~60%，光照3000lux，光照时间12h/d培养箱中进行生根培养，培养25~33d，主根长1.5~4cm，获得组培苗，周而复始获得大量组培苗，其诱根培养基具体参数为：1/2ms+0.2mg/lnaa+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果是，从表面消毒的种子培养获得无菌苗，避免了让外植体从野外环境过渡到室内环境，减少了外植体脱分化所需的时间，并且减少了外植体自身的含菌量，从而极大的降低了外植体的内缘性污染；能够再次获得愈伤组织，并能够增加组培苗分化的成功率，极大的增加获得组培苗的效率，有利于工业化大批量生产，形成繁殖系数高的技术效果；本发明在愈伤诱导和分化培养过程中，采用不同的培养条件和培养基，避免了愈伤组织和分化苗的褐化与玻璃化，形成了良好的培养效果。

附图说明

附图1为本发明外植体脱分化形成的愈伤组织实物图片。

附图2为本发明增殖培养扩繁获得的愈伤组织实物图片。

附图3为本发明胚性愈伤组织锻炼培养获得的胚性愈伤组织实物图片。

附图4为本发明芽诱导培养获得的丛生芽实物图片。

附图5为本发明获得的组培苗实物图片。

具体实施方式

下面结合实施例的详细步骤对本发明作进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。

a.将木棉种子用10%的过氧化氢表面消毒10min，埋入装有高压蒸汽灭菌2h的河沙的磁盘中育苗，置于25℃，湿度75%，光照3000lux，光照时间12h培养箱中培养育苗，待木棉种子长成6cm高的幼苗，去除幼苗的根和叶获得的木棉苗的幼茎作为外植体；

b.在超净工作台中，将去根和叶片的木棉幼苗茎段放入无菌蒸馏水中浸泡30min，然后用75%的乙醇消毒30s，再用0.1%hgcl2消毒6min，用无菌蒸馏水冲洗5遍去除木棉苗表面的消毒液，再用无菌滤纸吸干外植体上多余的水分；

c.将木棉幼苗茎段用解剖刀切成长0.5cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基，每个培养皿5个，置于24~26℃，湿度70~75%的培养箱中暗培养16d脱分化成愈伤组织，愈伤组织诱导培养基的具体参数为：ms+2mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+5g/l葡萄糖+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

d.将愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基，每皿接种3~5个切成直径为0.3~0.5cm的愈伤组织小块，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，12d后，愈伤组织长至0.8~1.2cm的淡黄色球状体，其愈伤组织增殖培养基具体参数是：ms+0.5mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+5g/l葡萄糖+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

e.将扩繁的愈伤组织块切成直径为0.5cm的愈伤组织小块，接入胚性愈伤组织锻炼培养基，每皿3~5个培养，置于温度为24~26℃，湿度为55~60%，光照2000lux，光照时间12h/d的培养箱中继续培养10~12d，获得胚性愈伤组织，其胚性愈伤组织锻炼培养基具体参数是：1/4ms+0.1mg/lnaa+0.5mg/l6-ba+20g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8-6.0；

f.将胚性愈伤组织接入诱芽培养基培养，温度为24~26℃，湿度为60~65%，光照3000lux，光照时间12h/d培养箱中培养，获得丛生芽和愈伤组织，其诱芽培养基具体参数为：ms+0.1mg/lnaa+1mg/l6-ba+20g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0；

g.将芽基部的愈伤组织切下放入新的愈伤组织增殖培养基中进行新一轮的增殖培养和胚性愈伤组织锻炼培养，将切下来的芽插入装有诱根培养基培的三角瓶中，置于温度为24~26℃，湿度为55~60%，光照3000lux，光照时间12h/d培养箱中进行生根培养，培养26~30d，主根长2~3cm，获得组培苗，周而复始获得大量组培苗，其诱根培养基具体参数为：1/2ms+0.2mg/lnaa+15g/l蔗糖+7.8g/l琼脂粉，灭菌前ph调至5.8~6.0。

该实例中木棉幼茎的愈伤诱导率在100%，所需诱导时间为10d，外植体污染率为0，愈伤组织芽分化率在81%以上，丛生苗的分化率在80%。