本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，特别涉及一种利用猕猴桃叶片进行组织培养的方法。
背景技术：
：猕猴桃(学名：actinidiachinensisplanch)，是多年生木质藤本植物，猕猴桃的质地柔软，口感酸甜。味道被描述为草莓、香蕉、菠萝三者的混合。猕猴桃除含有猕猴桃碱、蛋白水解酶、单宁果胶和糖类等有机物，以及钙、钾、硒、锌、锗等微量元素和人体所需17种氨基酸外，还含有丰富的维生素c、葡萄酸、果糖、柠檬酸、苹果酸、脂肪。传统猕猴桃的繁殖方法有播种、扦插、压条和嫁接等。这些方法相对效率较低，目前，已经有很多使用组织培养的方法进行猕猴桃繁育，例如：专利cn102177847a公开了一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法，包括培养基的配制、外植体的选取与消毒、接种、继代培养、沙床移栽五个步骤。但这种方法需要配置成分复杂且培养基配置过程要求严格的基本培养基、诱导培养基和继代培养基，操作过程繁琐，需要投入较多的人力和设备成本，不具有广泛的适用性。但是现有的组织培养的方法中。存在很多缺点，特别是在生根阶段都是需要含糖培养基，但是糖是污染源，容易增大生根阶段的污染率，而且，传统方法生根时只能获得3-5个主根，而且没根毛，如图2所示，需后期炼苗培养。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种利用猕猴桃叶片进行组织培养的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：叶片外植体诱导愈伤组织法1.选取健壮植株上翠绿、厚实，离茎尖比较近的叶片做外植体材料，清水洗干净；用0.1％氯化汞溶液灭菌10min，再用75％的酒精灭菌5min，无菌水清洗3—5遍；把处理后的叶片剪成边长1.5cm大小的方块，放入诱导培养基上，光照800lx，每天10h，温度25±2℃，湿度70％，培养50天左右形成猕猴桃愈伤组织。诱导培养基为：ms培养基+蔗糖20g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+naa(萘乙酸)0.2mg/l+2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)0.5mg/l的培养基；2.诱导丛生芽把愈伤组织分割成直径1cm左右的小块，清除掉已经死亡的叶片组织，半嵌到ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba5mg/l+naa0.5mg/l+iaa0.2mg/l的培养基中，光照2000-2500lx，时间14h，温度25±2℃，湿度70％，培养50天后愈伤组织表面形成不定芽，获得初代。3.继代培养(增殖培养)把愈伤组织上形成的不定芽插入ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba1.2mg/l+iaa0.8mg/l的培养基上，光照2000-3000lx，14h，温度25±2℃，湿度70％，培养25天左右，增值率3-5倍。4.诱导生根把增殖后达到3cm以上，具有3片以上子叶的植株插入专用生根设备里面的基质上，该基质为ms+蛭石，光照时间16h，温度25±2℃，湿度80％，二氧化碳浓度900ppm-1000ppm，培养室洁净度1000级以上。培养20天以后形成根系发达的猕猴桃完整植株。ms+蛭石为每升ms溶液加800g蛭石。5.把猕猴桃完整植株移栽到降解袋里面，移植到温棚，温度15-30℃，湿度85％，一周后即可移到大田，成活率99％以上。本发明采用无性繁殖方式，使母本的优良性状完整保留，并通过茎尖脱毒技术使继代比母本更加优良。并突破了木本组培苗生根质量差的难题，组培苗根系发达，完整，成活率高，无须炼苗，能缩短生产周期60天左右。附图说明：图1为：实施例1中猕猴桃诱导生根完成后状态；图2为：传统组织培养诱导生根完成后状态；图3：实施例3的立体结构示意图；图4：实施例3的剖面结构示意图；图5：实施例3所述根床的俯视结构示意图。具体实施方式以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：实施例1以徐香猕猴桃叶作为组培材料，使用本发明的方法进行组织培养。1.选取健壮猕猴桃植株上翠绿、厚实，离茎尖比较近的叶片做外植体材料，清水洗干净；用0.1％升汞溶液灭菌10min，再用75％的酒精灭菌5min，无菌水清洗3—5遍；把处理后的叶片剪成边长1.5cm大小的方块，放入诱导培养基上，光照800lx，每天10h，温度25±2℃，湿度70％，培养50天左右形成猕猴桃愈伤组织。诱导培养基为：ms培养基+蔗糖20g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+naa(萘乙酸)0.2mg/l+2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)0.5mg/l的培养基；2.诱导丛生芽把愈伤组织分割成直径1cm左右的小块，清除掉已经死亡的叶片组织，半嵌到ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba5mg/l+naa0.5mg/l+iaa0.2mg/l的培养基中，光照2000-2500lx，时间14h，温度25±2℃，湿度70％，培养50天后愈伤组织表面形成不定芽，获得初代，如图3所示。3.继代培养(增殖培养)把愈伤组织上形成的不定芽插入ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba1.2mg/l+iaa0.8mg/l的培养基上，光照2000-3000lx，14h，温度25±2℃，湿度70％，培养25天，增值率3-5倍，如图4所示。4.诱导生根把增殖后达到3cm以上，具有3片以上子叶的植株插入专用生根设备(如实施例3)里面的基质上，该基质为ms+蛭石，光照时间16h，1500-2000lx，温度25±2℃，二氧化碳浓度950ppm，湿度80％，培养室洁净度1000级以上。培养20天以后形成根系发达的猕猴桃完整植株。如图5所示。5.把猕猴桃完整植株移栽到降解袋里面，移植到温棚，温度15-30℃，湿度85％，一周后即可移到大田，成活率99％以上。实施例2以徐香猕猴桃叶作为组培材料，使用不同的方法进行组织培养。实验组：使用本发明实施例1的方法；对照1组：诱导生根步骤所采用的培养基为：0.7mg·l-1iba、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1琼脂的1/2ms培养基，其他与实验组相同。对照2组：诱导生根步骤所采用的培养基为：在1/2ms+naa0.2mg·l-1，其他与实验组相同。对照3组：诱导生根步骤所采用的光照时间10h，温度25±2℃，湿度85％，其他与实验组相同。对照4组：诱导生根步骤所采用的二氧化碳浓度1200ppm，其他与实验组相同。生根污染率移栽成活率生根情况是否炼苗实验组0.5％99％好否对照1组5％86％一般是对照2组6％91％一般是对照3组1％95％较好否对照4组1％93％一般是实施例3一种组织培养专用生根设备，如图3至图5所示，包括：盒体1、盒盖2和根床3，所述盒盖2通过合页26与盒体1相连接，可相对盒体1翻转；所述根床3由若干相互垂直的隔板组成，所述根床3具有若干个相互独立的井字形的用于容置培养基的根床区域30，所述盒盖2的底面上设置有led灯20，所述盒体1的侧壁面上开设有若干通风孔10，所述通风孔10所处位置高于根床3的顶面。通过根床3可以将猕猴桃苗生长的根都分隔，避免了培苗完成后，它们的根系缠绕于一起，将它们分离时费时费力且易损伤根系。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12