本发明涉及一种持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续改良的方法。
背景技术：
“医食同源”是发展方向，“吃营养，吃健康”已成为人们的共识。苹果果实含有较多的人体容易吸收的游离多酚或类黄酮，在抗氧化、预防心脑血管疾病及抗肿瘤等方面均具有较好的作用，“一天一苹果，医生远离我”，世界上相当多的国家都将苹果作为主要消费果品而大力推荐。苹果果实的红皮和红肉性状主要由花青苷发育而来，是类黄酮的主要组分。为此，进一步选育花青苷(或类黄酮)含量高、外观品质好、保健价值大的苹果新品种，对推动苹果产业发展、改进人类健康具有重要意义。
果肉红色、类黄酮含量高的功能型苹果育种是多个品质性状(基因)的有效集成与平衡，为完善新品种选育方案，提高育种效率，课题组采取了三项措施：一是在新疆红肉苹果与苹果品种杂种一代果实总酚含量等性状遗传变异研究的基础上，提出并实施了“三选两早一促”的苹果育种法(专利号zl201310205419.6)，育种效率显著提高；二是利用遗传背景复杂的‘嘎啦’、‘美国八号’、‘寒富’及‘富士’等苹果品种与新疆红肉苹果(m.sieversiif.niedzwetzkyana)进行多亲本杂交与反复回交，旨在进行品质育种，目前已构建回交一、二代分离群体40个，定植杂种实生苗4万株，并申报了“果树多种源品质育种法(专利申请号201510428448.8)”及“易着色苹果品种培育法(专利申请号201510890141.x)”2个育种技术发明专利；三是及时地以性状基本稳定的后代株系为试材，进行品质性状评价及发育机理的研究，并已取得了诸多重要进展。目前，已创建了常规杂交与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系，创制了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品种配套高效栽培技术体系。授权和申报发明专利10余项，育成新品种(系)16个；发表相关研究论文120篇，其中sci论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续改良的方法。
本发明首先保护一种苹果育种方法(方法甲)，包括如下步骤：将苹果品种c0进行持续多代的芽变选种，第一代芽变选种将苹果品种co作为出发品种，以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种，每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目标品种：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下；
所述特异dna分子为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
(ⅰ)序列表的序列1所示的dna分子；
(ⅱ)将序列表的序列1所示的dna分子进行一个或几个核苷酸的插入和/或缺失和/或替换得到的dna分子；
(ⅲ)与序列表的序列1所示的dna分子具有90％以上同源性的dna分子。
所述多代为2代以上，可为2代、3代、4代、5代、6代等。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(d1)和/或(d2)：(d1)着色速度大于苹果品种c0；(d2)着色指数大于苹果品种c0。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(d3)和/或(d4)：(d3)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(d4)着色指数为80％以上。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(d5)和/或(d6)：(d5)着色速度为“除袋之后4天以内着色”；(d6)成熟果实表皮80％以上为宝石红色。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(d7)和/或(d8)：(d7)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(d8)着色指数为90％以上。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(d9)和/或(d10)：(d9)着色速度为“除袋之后4天以内着色”；(d20)成熟果实表皮90％以上为宝石红色。
所述苹果品种c0具体可为‘红富士’苹果或‘嘎啦’苹果。
本发明还保护一种苹果育种方法(方法乙)，包括如下步骤：将苹果品种c0进行持续多代的芽变选种，第一代芽变选种将苹果品种co作为出发品种，以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种，每代芽变选种从全满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目标品种：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下；(d)芽发育成的枝条或植株上生长枝条的节间长度为2cm以下；
所述特异dna分子为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：
(ⅰ)序列表的序列1所示的dna分子；
(ⅱ)将序列表的序列1所示的dna分子进行一个或几个核苷酸的插入和/或缺失和/或替换得到的dna分子；
(ⅲ)与序列表的序列1所示的dna分子具有90％以上同源性的dna分子。
所述多代为2代以上，可为2代、3代、4代、5代、6代等。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(e1)和/或(e2)和/或(e3)：(e1)着色速度大于苹果品种c0；(e2)着色指数大于苹果品种c0；(e3)枝条的节间长度为2cm以下。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(e4)和/或(e5)和/或(e6)：(e4)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(e5)着色指数为80％以上；(e6)枝条的节间长度为2cm以下。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(e7)和/或(e8)和/或(e9)：(e7)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(e8)成熟果实表皮80％以上为浓红色；(e9)枝条的节间长度为2cm以下。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(e10)和/或(e11)和/或(e12)：(e10)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(e11)着色指数为90％以上；(e12)枝条的节间长度为2cm以下。
所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标(e13)和/或(e14)和/或(e15)：(e13)着色速度为“除袋之后5天以内着色”；(e14)成熟果实表皮90％以上为浓红色；(e15)枝条的节间长度为2cm以下。
所述苹果品种c0具体可为‘红富士’苹果或‘嘎啦’苹果。
本发明还保护一种苹果育种方法(方法丙)，包括如下步骤：
(1)将苹果品种a和苹果品种b进行杂交，获得杂交种子；所述苹果品种a为苹果(malusdomestica)csr6r6-666；所述苹果品种b为以上任一所述方法得到的苹果品种；
(2)将步骤(1)得到的杂交种子播种并育苗，得到实生苗；
(3)将步骤(2)得到的实生苗移栽至大田，待其长出果实后不对果实进行套袋，筛选得到目的植株。
所述将苹果品种a和苹果品种b进行杂交的方法如下：取苹果品种a的花粉，对去雄后的苹果品种b进行授粉。
所述步骤(2)中，进行所述播种前，先将所述杂交种子进行1-3℃层积处理以打破休眠。所述层积处理的时间具体可为60天。
所述步骤(2)中,进行所述育苗的条件为：25℃、每天光照12小时、光照强度3000lx，从种子萌发开始每7-10天浇一次营养液。
所述步骤(2)中,进行所述育苗的条件具体为：将所述杂交种子播种于装有育苗基质的营养钵(每个营养钵播种3-5粒种子)培养至实生苗高度为8-15cm且根颈处木质化(通常为播种2-3个月)，然后将实生苗移栽至新的装有育苗基质的营养钵(每个营养钵移栽1株)进行培养；所述培养的条件为：25℃、每天光照12小时(光照强度3000lx)，从种子萌发开始每7-10天浇一次营养液(将ms基本培养基的大量元素母液用水稀释至10倍体积即为营养液)、每次每个营养钵浇40-50ml。
所述步骤(3)中,在所述大田中进行栽培管理的方法如下：在拟定植实生苗的大田中每亩施入有机肥6000kg并浇水沉实，定植实生苗后在大田中每亩再施入有机肥6000kg并及时浇水。所述有机肥具体可为充分腐熟的奶牛粪。
所述方法中，移栽第4年，在离地面20cm处对实生苗的主干进行环剥，环剥宽度为0.5-1.0cm，深达木质部。
所述方法中，移栽第5年，在实生苗的盛花期进行如下操作：每个花序的5朵花仅保留中心花，其他全部疏除。
所述方法中，移栽第5年得到所述目的植株。
所述目的植株为果肉全红的植株。
所述目的植株为满足如下(f1)和/或(f2)和/或(f3)和/或(f4)的苹果植株：(f1)果肉全红；(f2)果肉高类黄酮含量；(f3)果肉高花青苷含量；(f4)果肉高抗氧化能力。所述果肉高类黄酮含量指的是每千克鲜重的果肉中的类黄酮的含量为5000mg以上。所述果肉高花青苷含量指的是每千克鲜重的果肉中的花青苷含量为200mg以上。果肉高抗氧化能力指的是每千克鲜重的果肉中的抗氧化能力(又称抗氧化物含量)为3μmol以上。
本发明还保护苹果(malusdomestica)csr6r6-666在苹果育种中的应用。所述应用中，苹果csr6r6-666作为亲本之一。所述应用中，苹果csr6r6-666作为父本。所述育种的目的为获得果肉全红的植株。
‘csr6r6-666’，又称苹果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.13783。
本发明加强芽变选种工作，建立杂交育种与芽变选种优势互补、常规技术与生物技术有机结合的高效育种技术体系，对苹果红色性状的持续改良具有重要意义。
附图说明
图1为红富士、品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果。
图2为红富士、品种甲和品种乙的果皮中的特异dna分子甲基化水平检测结果。
图3为品种甲的照片。
图4为品种乙的照片
图5为品种丁的照片，
图6为嘎啦的照片。
图7为品种己的照片。
图8为苹果新品系‘功能1号’的照片。
图9为苹果新品系‘功能2号’的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
着色指数指的是：成熟苹果果实表皮，红色区域面积占表皮总面积的比例。
芦丁的结构式如下：
trolox的结构式如下：
80％丙酮溶液：将4体积份丙酮与1体积份水混合。
1％盐酸甲醇溶液：97.2ml甲醇与2.8ml浓盐酸混合。浓盐酸即市售12mol/l盐酸。
0.5％盐酸甲醇溶液的制备方法：将0.5体积份35％浓盐酸与99.5体积份甲醇混合。
提及‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果的参考文献：陈学森，辛培刚等，元帅和金帅在苹果新品种选育中的作用，山东农业大学学报，1994，25(2)：236—248。
实施例1、通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立
一、苹果红色芽变的特点
调研发现，苹果的红色芽变具有如下三个特点：
(1)苹果红色芽变的重演性
调研发现，苹果的红色芽变可在国内外不同地区及不同年份重复发生，表现出芽变的重演性。这为有效利用芽变选种技术对苹果红皮性状持续改良提供了科学依据。
(2)苹果红色芽变的多效性
对多个苹果红色芽变品种进行调研发现，尽管均是红色芽变，但不同芽变品种(系)在着色类型(条红或片红)、着色速度以及对光的敏感程度等存在明显差异。这为有效利用芽变选种技术选育特色多样化品种、满足消费者和栽培者的多样化需求提供了科学依据；
(3)苹果红色芽变的稳定性
对多个苹果红色芽变品种嫁接繁殖后的稳定性进行了调研，结果表明，苹果红色芽变具有很好的遗传稳定性和一致性。这为苹果红色芽变品种的大面积推广应用提供了科学依据。
二、芽变的机理
经过发明人的大量研究，苹果的红色芽变是特异dna分子甲基化水平差异引起的表观遗传。特异dna分子如序列表的序列1所示。
经检测，‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果的基因组中均具有序列表的序列1所示的特异dna分子。
三、通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立
建立如下方法：将苹果品种c0进行持续多代的芽变选种，第一代芽变选种将苹果品种co作为出发品种，以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种，每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目标品种：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
检测果皮的花青苷含量的方法如下：
①取0.5g果皮，液氮研磨，加入5ml4℃预冷的1％盐酸甲醇溶液，4℃避光静置，提取24h。
②完成步骤①后，取提取液，分为两份，每份1ml，一份加入4mlkcl缓冲液，另一份加入4mlnaac缓冲液，混匀后4℃避光静置提取15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。
kcl缓冲液(ph＝1、0.025m)：1.86gkcl用980ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调ph为1.0，转移到1l容量瓶中，用蒸馏水定容。
naac缓冲液(ph＝4.5、0.4m)：54.43gnaac用960ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调ph为4.5，转移到1l容量瓶中，用蒸馏水定容。
③取步骤②得到的上清液，分别测定510nm和700nm下的吸光值。
花青苷含量(mg/g)＝△a*5*0.005*1000*449.2/(26900*0.5)；
△a＝(a510nm-a700nm)ph1.0条件下-(a510nm-a700nm)ph4.5条件下。
“mg/g”中，mg指的是花青苷的质量，g指的是果皮鲜重。
检测果皮的特异dna分子的甲基化水平的方法如下：
①利用qiagen植物基因组dna抽提试剂盒提取果皮的基因组dna。
②取步骤①得到基因组dna，采用ezdnamethylation-gold试剂盒进行亚硫酸盐转化，得到亚硫酸盐处理的dna。
③取步骤②得到的亚硫酸盐处理的dna，作为模板，分两个体系进行pcr扩增。
pcr扩增体系ⅰ：10×extaqbuffer2.5μl，dntpmixture2μl，引物f12μl、引物r12μl，takaraextaqhs0.5μl，模板4μl，ddh2o12μl。
pcr扩增体系ⅰ的反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、51℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共进行40个循环；72℃延伸10分钟。
pcr扩增体系ⅱ：10×extaqbuffer2.5μl，dntpmixture2μl，引物f22μl、引物r22μl，takaraextaqhs0.5μl，模板4μl，ddh2o12μl。
pcr扩增体系ⅱ的反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共进行40个循环；72℃延伸10分钟。
引物f1：5’-taggtttgaagaattaattagggat-3’；
引物r1：gggaaattttggtttttatatggtttag-3’。
引物f2：ttttattttttatatatattatgttatt-3’；
引物r2：ggattatgttattagatggt-3’。
④分别将步骤③的两个体系的扩增产物进行测序，利用cymate软件(hetzletal.,2007)输出甲基化水平数据。
特异dna分子的甲基化水平＝(体系ⅰ的甲基化水平数据+体系ⅱ的甲基化水平数据)÷2。
实施例2、应用实施例1建立的方法通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良
本实施例中检测果皮的花青苷含量的方法和检测果皮的特异dna分子的甲基化水平的方法同实施例1。
一、红富士苹果红色芽变新品种选育
1、第一代芽变选种：
将红富士作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为红富士的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种甲。
2、第二代芽变选种：
将品种甲作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种甲的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为品种甲的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种乙。
红富士、品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果见图1。品种甲的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上，品种乙的果皮的花青苷含量为品种甲的2倍以上。
红富士、品种甲和品种乙的果皮中的特异dna分子甲基化水平检测结果见图2。品种甲的果皮的特异dna分子的甲基化水平是红富士的二分之一以下，品种乙的果皮的特异dna分子的甲基化水平是品种甲的二分之一以下。
红富士的果皮颜色性状：着色速度较慢(除袋之后10-15天着色)，着色指数为25％-35％(成熟果实表皮，25％-35％显示为浅红色、剩余部分显示为黄色或绿色)。红富士的果肉颜色性状：乳白色果肉。
品种甲的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后6-9天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种甲的照片见图3。品种甲的果肉颜色性状：乳白色果肉。
品种乙的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-4天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为宝石红色)。品种乙的照片见图4。品种乙的果肉颜色性状：乳白色果肉。
二、红富士苹果红色、短枝双芽变优质短枝型新品种选育
1、第一代芽变选种：
将红富士作为出发品种，将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为红富士的二分之一以下；(d)芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为2cm以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种丙。
2、第二代芽变选种：
将品种丙作为出发品种，将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种丙的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为品种丙的二分之一以下；(d)芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为2cm以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种丁。
红富士的果皮颜色性状：着色速度较慢(除袋之后10-15天着色)，着色指数为25％-35％(成熟果实表皮，25％-35％显示为浅红色、剩余部分显示为黄色或绿色)。红富士的果肉颜色性状：乳白色果肉。
品种丙的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后7-10天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种丙的果肉颜色性状：乳白色果肉。品种丙的短枝性状：节间长度为2cm以下。
品种丁的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-5天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为浓红色)。品种丁的照片见图5。品种丁的果肉颜色性状：乳白色果肉。品种丁的短枝性状：节间长度为2cm以下。
三、嘎啦苹果红色芽变新品种选育
1、第一代芽变选种：
将嘎啦作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为嘎啦的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为嘎啦的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种戊。
2、第二代芽变选种：
将品种戊作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种戊的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异dna分子的甲基化水平为品种戊的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。
将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种己。
嘎啦的果皮颜色性状：着色速度较慢(除袋之后8-12天着色)，着色指数为25％-35％(成熟果实表皮，25％-35％显示为浅红色、剩余部分显示为黄色或绿色)。嘎啦的果肉颜色性状：乳白色果肉。嘎啦的照片见图6。
品种戊的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后5-8天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种戊的果肉颜色性状：乳白色果肉。
品种己的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-5天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为浓红色)。品种己的照片见图7。品种己的果肉颜色性状：乳白色果肉。
实施例3、苹果优异种质‘csr6r6-666’的获得和鉴定
鉴定苹果植株为r1r1基因型、r6r6基因型还是r6r1基因型的方法如下：从待测苹果植株上取苹果，提取苹果果肉的基因组dna，以基因组dna为模板，采用f3和r3组成的引物对进行pcr扩增，然后按如下标准判读基因型：如果pcr扩增产物为一条带且为497bp，待测苹果植株为r6r6基因型；如果pcr扩增产物为一条带且为386bp，待测苹果植株为r1r1基因型；如果pcr扩增产物为两条带且分别为497bp和386bp，待测苹果植株为r6r1基因型。
f3：5’-ggtggtcaaagatgtgtgttgt-3’；
r3：5’-tttgcctgctacccacttca-3’。
经检测，‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果均为r1r1基因型。
一、‘csr6r6-666’的获得
新疆红肉苹果作为亲本，与‘红富士’等白肉栽培苹果品种杂交。按照孟德尔遗传定律，新疆红肉苹果(r6r1基因型)与‘红富士’(r1r1基因型)等白肉栽培苹果品种杂交,其后代群体应为红肉表型(r6r1基因型):白肉表型(r1r1基因型)＝1:1。但是，在杂交f1代群体中发现了r6r6基因型的单株。
将一株r6r6基因型的单株命名为‘csr6r6-666’。
‘csr6r6-666’具有如下表型：茎、叶、花、果皮和果肉等各部分及各个发育阶段均为紫红色。
二、‘csr6r6-666’的保藏
‘csr6r6-666’，又称苹果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.13783。
三、‘csr6r6-777’的保藏
‘csr6r6-777’是发明人所在的实验室前期选育出来的另一株r6r6基因型的单株。
‘csr6r6-777’，又称苹果(malusdomestica)csr6r6-777，已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.12468。
四、类黄酮组分含量分析
分别将‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’作为待测植株。
1、取待测植株上的苹果，取苹果果肉。
2、取步骤1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。
3、称取2g步骤2得到的粉末，加入5ml0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取2h，然后8000rpm离心20min，分别收集上清液和残渣。
4、取步骤3得到的残渣，加入5ml0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取1h，然后8000rpm离心20min，收集上清液。
5、将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液混合，得到混合液。
6、取步骤5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，残留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm离心20min，收集上清液。
7、取步骤6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
8、将步骤7得到的滤液进行hplc-ms分析。
液相色谱条件：
采用watersacquityuplc色谱仪，色谱柱为behc18柱(100mm×2.1mm)，填料粒径1.7μm；柱温45℃；进样体积1μl；
流动相为a液和b液的混合液，流速为0.3ml/min；a液为乙腈，b液为含0.2％(体积分数)甲酸的水溶液；0-0.1min，a液占流动相的体积分数为5％；0.1-20min，a液占流动相的体积分数由5％线性上升至20％；20-22min，a液占流动相的体积分数由20％线性上升至80％；22-22.1min，a液占流动相的体积分数由80％线性下降至5％；22.1-25min，a液占流动相的体积分数为5％。
质谱条件：
质谱仪为watersmaldisynaptq-tofms，esi电离源，电喷雾离子化正离子采集模式(esi+)；扫描范围100-1500m/z；毛细管电压3.5kv，锥孔电压30v；源温度100℃，脱溶温度300℃；脱溶剂气流量500l/h。
9种特定黄酮醇物质的含量见表1。表1中的9种特有物质的检测方法均属于类黄酮组分及含量检测方法，参考文献(陈学森,张晶,刘大亮,等.新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异及功能型苹果优株评价[j].中国农业科学,2014,47(11):2193-2204.。
表1
以上结果表明，‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’均具有很强的类黄酮合成能力，果肉富含类黄酮，并且含有特殊的黄酮醇类组分，是培育功能型苹果品种的优异种质。‘csr6r6-666’优于‘csr6r6-777’。
实施例4、芽变选种和杂交育种有机结合培育‘功能1号’功能型苹果新品系
一、功能型苹果新品系
1、回交(在山东烟台市牟平区进行)
2011年4月，取‘csr6r6-666’的花粉，对去雄后的品种乙进行授粉，收获bc1杂交种子，将bc1杂交种子洗净后放到1-3℃冰箱保鲜室层积处理60d左右(目的是通过满足需冷量来解除种子休眠)。
2、温室育苗(在山东泰安进行)
2011年12月，将步骤1得到的bc1杂交种子播种于装有育苗基质的营养钵(每个营养钵播种3-5粒种子)培养至实生苗高度为8-15cm且根颈处木质化(通常为播种2-3个月)，然后将实生苗移栽至新的装有育苗基质的营养钵(每个营养钵移栽1株)进行培养；本步骤中的培养条件为：25℃、每天光照12小时(光照强度3000lx)，从种子萌发开始每7-10天浇一次营养液(将ms基本培养基的大量元素母液用水稀释至10倍体积即为营养液)、每次每个营养钵浇40-50ml。
3、杂种实生苗定植(在山东冠县进行)
2012年2月，在拟定植实生苗的选种圃(大田)中每亩施入有机肥(本实施例中采用的为充分腐熟的奶牛粪)6000kg并浇水沉实；2012年4月，将3600株步骤2得到的实生苗定植于选种圃，2012年4月在定植有实生苗的选种圃中每亩再施入有机肥(本实施例中采用充分腐熟的奶牛粪)6000kg并及时浇水。
4、杂种实生苗环剥处理
2015年5月，在离地面20cm处对各实生苗的主干进行环剥，环剥宽度为0.5-1.0cm，深达木质部。此操作的目的是促进营养物质的积累及花芽分化，以缩短童期、提早结果。
5、花果管理
2016年4-5月，在各实生苗的盛花期进行疏花(每个花序的5朵花仅保留中心花，其他全部疏除)。幼果不套袋，常规管理。
6、功能型苹果新品系‘功能1号’的获得
2016年9月，从回交后代群体中选育出功能型苹果新品系‘功能1号’(照片见图8)。‘功能1号’的果肉全红、果皮全红。
二、类黄酮含量、花青苷含量及抗氧化能力分析
待测材料：‘功能1号’上生长的苹果、‘csr6r6-666’上生长的苹果和‘csr6r6-777’上生长的苹果。
1、果肉的类黄酮含量测定
(1)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml4℃预冷的65％(体积百分含量)乙醇水溶液并混匀，4℃避光静置提取4h，然后12000g离心20min，收集上清液。
(2)取试管，加入0.5ml步骤(1)得到的上清液，然后依次加入1ml5g/100mlnano2水溶液、1ml10g/100mlal(no3)3水溶液、4ml2mnaoh水溶液，混匀后静置15min，8000rpm离心10min，取上清，然后在510nm下测定吸光值。
以芦丁(rutin,sigmachemical,st,loiuis,usa)为标样做标准曲线。
2、果肉的花青苷含量测定
(1)取0.5g果肉，液氮研磨，加入5ml4℃预冷的1％盐酸甲醇溶液，4℃避光静置提取24h。
(2)取步骤(1)得到的提取液，分成2份，每份1ml，第一份加入4mlkcl缓冲液，第二份加入4mlnaac缓冲液，混匀后4℃避光静置提取15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。
kcl缓冲液(ph＝1、0.025m)：1.86gkcl用980ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调ph为1.0，转移到1l容量瓶中，用蒸馏水定容。
naac缓冲液(ph＝4.5、0.4m)：54.43gnaac用960ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调ph为4.5，转移到1l容量瓶中，用蒸馏水定容。
(3)取步骤(2)得到的上清液，分别测定510nm和700nm下的吸光值。
花青苷含量(mg/g)＝△a*5*0.005*1000*449.2/(26900*0.5)；
△a＝(a510nm-a700nm)ph1.0条件下-(a510nm-a700nm)ph4.5条件下。
“mg/g”中，mg指的是花青苷的质量，g指的是果肉鲜重。
3、果肉的抗氧化能力测定
(1)取果肉，液氮研磨，得到粉末。
(2)称取10g步骤(1)得到的粉末，加入50ml80％丙酮溶液，4℃静置提取2h，8000rpm离心10min，收集上清。
(3)取完成步骤(2)的残渣，加入50ml80％丙酮溶液，4℃静置提取1h，8000rpm离心10min，收集上清。
(4)将步骤(2)得到的上清和步骤(3)得到的上清合并，得到混合液。
(5)取步骤(4)得到的混合液，40℃旋蒸除去丙酮，残留部分5000rpm离心，取上清液，用去离子水定容至20ml，得到待测样品。
(6)10体积份乙酸缓冲液、1体积份20mmfecl3·6h2o水溶液和1体积份tptz溶液混合，37℃水浴5min。
乙酸缓冲液(ph3.6、300mm)：16.8克冰醋酸和0.8克氢氧化钠与水配制成1升溶液。
tptz溶液：含10mm2,4,6–三吡啶基三嗪和40mm盐酸的水溶液。
(7)完成步骤(6)后，取4ml溶液，与30μl待测样品混合，37℃静置反应120min，然后593nm测其吸光度。以trolox为标样做标准曲线。
结果见表2。
实施例5、芽变选种和杂交育种有机结合培育‘功能2号’功能型苹果新品系
用品种己代替品种乙，按照实施例4的步骤进行操作。
2016年7月，从回交后代群体中选育出功能型苹果新品系‘功能2号’(照片见图9)。‘功能2号’的果肉全红、果皮全红。
结果见表2。
表2
序列表
<110>山东农业大学
<120>持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续改良的方法
<130>gncyx180711
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>841
<212>dna
<213>malusdomestica
<400>1
taggcttgaagaatcaattagggatttacaaaatgattaaagggattttgggtgtttgct60
gttgccatttttgaacacaacatcagttccactactctttcattttccctcaatttctga120
gcaaccaaacaagtagcattattgacaacatactgagctcctcgtgtcaaccattcttga180
aagaatcctaataaagatttataggcaaattatgccctagaaaaaatttaataaaaagga240
ccctgaacacgtaggaaccggcccgtttgtaacagactgagataggtccggttctatttc300
ttaaaaacccaacacccgctacgttccatttataaacgggtcggtctggtccctccaact360
ttgagcccggctcgacttgtgcccactcctaaactaaaccatataaaaaccaagatttcc420
ctttcatctttcacacatatcacgttactttccaacaacaattcaacaatcacaacaaat480
aatcaaccatcaagatcatatatcacgtcactaataaagacaaccttcataagggttgcc540
gtagttctctacttgaaatccaattgtctagcattgtaaccctaagttacagacacaaac600
ataaacttgagcaacttctatgcataagaatctagggttttggactaactcaacagaacc660
taacaagaaataatattctggaccgcttaacggaatccaacgaagacaaggtttcggacc720
actcaacggaacaaataaggaagggatataaaccattcaacgaaatccatctttagaata780
cgcatagtcccccaatacggattaaccaagtgagaacatacgccatctgatagcgtggtc840
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