本发明涉及冬瓜种质资源创制技术领域，特别地，涉及一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法。
背景技术：
冬瓜是我国主要蔬菜作物，年播种面积约480万亩，冬瓜产品对于调节我国蔬菜周年供应发挥着重要作用。由于冬瓜主要分布在我国、印度、越南、老挝等东南亚国家，然而，相对于其他蔬菜作物，冬瓜材料遗传背景较窄，严重的限制了冬瓜新材料的创制和优质资源的扩大选育。目前，冬瓜缺少耐涝种质资源，而冬瓜主要种植区域在长江流域及以南地区，在种植过程中经常遭遇洪涝灾害，造成巨大的经济损失，而目前通过现有的种质资源大田筛选很难获得抗涝冬瓜种质资源，冬瓜生产中遇到的洪涝灾害问题未能很好解决。
化学诱变剂ems(ethylmethanesulfonate甲基磺酸乙酯)是一种单功能烷化剂，是植物诱变中最常用的高效化学诱变剂之一，由于其在体内可以转变成缺电子的活泼中间产物，容易与碱基上的n原子和磷酸基团发生亲核取代反应，使dna结构改变，因此被广泛用作优质作物新材料创制的化学诱变剂。ems化学诱变技术已经在甜瓜、小麦、水稻、玉米、西瓜、黄瓜等多种作物上取得理想的诱变效果，获得了一些基因型改变的作物，对作物功能基因组学研究和新品种创制及扩大选育起着重要的推动作用。
创建突变体库筛选突变体可以为冬瓜育种提供新的种质材料，从而推进冬瓜种质创新，但目前还未见冬瓜相关的突变体库构建工作，因此开展冬瓜ems突变体诱变及耐涝突变体筛选具有重要意义。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，以解决现有技术中冬瓜缺少耐涝种质资源的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，包括以下步骤：
(1)采用ems诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于50-60℃的温汤中浸种25-40min；浸种后置于25-30℃恒温箱催芽30-40h；然后用体积比1-1.3％ems磷酸缓冲液处理10-15h，用终止液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗10-15h；
(2)种植处理的种子：将ems诱变剂处理过的冬瓜种子置于氧气体积浓度为10-15％的25-30℃的co2恒温催芽箱中催芽，挑选发芽的种子进行育苗床播种；
(3)突变体获得，具体为：
首先，m1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子标为m1，筛选催芽后穴盘育苗，自交授粉；将m1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得m2代种子；
其次，m2代的种植和选择：将m2代种子在氧气体积浓度为10-15％的25-30℃co2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；
然后，自交授粉，待座果进行过茎基部淹水处理，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体种子mut。
进一步地，步骤(1)中，所述冬瓜种子在浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀。
进一步地，步骤(1)中，将冬瓜种子用体积比1.2％ems磷酸缓冲液处理12h。
进一步地，所述ems溶液的配置为使用ph为7.4的0.2mol/l磷酸缓冲液配置体积浓度为1.2％的ems溶液。
进一步地，所述终止剂为质量浓度5％的na2s2o3溶液。
进一步地，步骤(3)中，所述冬瓜m2代种植后，自交授粉，待座果15-25d采用大田过茎基部淹水15-25cm处理3-4h，挑选出耐涝冬瓜株系。
进一步地，所述冬瓜种子为健康饱满的高代自交系冬瓜种子。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，用化学诱变剂ems对冬瓜高代自交系种子进行诱变处理，获得突变体库，扩大了种质资源来源，创制出新的种质资源。其中，采用体积比1.2％的ems磷酸缓冲液处理冬瓜种子12h，是冬瓜的半数处理剂量，可获得最大的诱变率，达到54.67％的发芽率和51.83％的成苗率。本方法简单，诱变效果显著。
本发明提供了一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，采用突变体种子催芽阶段低氧筛选，即将冬瓜种子置于氧气体积浓度为10-15％的25-30℃的co2恒温催芽箱中催芽，可获得耐涝能力增强突变体，通过m2代大田淹水筛选出耐涝冬瓜突变株系mut。通过对突变型mut和野生型wt冬瓜苗期不同淹水时间下的不定根萌发数量、长度、净光合速率和存活率进行对比以及对其叶片进行过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛、乙醇脱氢酶及羟自由基去除能力等差异分析，结果表明使用本发明方法诱变和筛选出的冬瓜突变体相对于野生型wt的冬瓜种子具有明显较强的的耐涝能力。本发明提供的一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，为冬瓜育种提供新的种质材料，从而推进冬瓜种质创新。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明提供了一种采用ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，包括以下步骤：
(1)ems诱变最佳条件筛选
在开展ems诱变剂创制冬瓜耐涝突变体之前，首先对ems诱变处理条件和方式进行了对比实验，首先挑选健康饱满的dz163冬瓜高代自交系种子，在诱变前，根据冬瓜萌发规律(冬瓜催芽需36h左右开始露白，72h左右萌发)，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于55℃的温汤中浸种30min，浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀；浸种后置于28℃恒温箱催芽36h。然后，进行不同ems浓度和时间处理。每种处理选取种子100粒。结果详见表1。
表1ems处理浓度和处理时间对冬瓜发芽率和成苗率的影响
从表1中可以看出：随着ems处理浓度及处理时间的增加，冬瓜种子发芽率及成苗率均呈下降趋势，其中浓度对冬瓜种子发芽率及成苗率的影响比处理时间的影响更明显。按照半数致死率的选取原则，选用最佳ems处理条件为ems浓度1.2％，处理时间12h，在该处理条件下可获得54.67％的发芽率和51.83％的成苗率。
(2)采用ems诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的dz163冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于55℃的温汤中浸种30min，浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀，浸种后置于28℃恒温箱催芽36h；用ph为7.4的0.2mol/l磷酸缓冲液配置体积比为1.2％的ems溶液，然后用1.2％ems磷酸缓冲液选择处理12h，用质量浓度为5％的na2s2o3溶液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗12h。
(3)种植处理的种子：将ems诱变剂处理过的冬瓜种子置于置于氧气体积浓度为12％的28℃的co2恒温催芽箱中催芽，及时在催芽盒中补充无菌水，保证冬瓜种子正常萌发。
(4)突变体获得，具体为：
首先，m1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子(标记为m1)，穴盘育苗，定植于网室大棚内，自交授粉；将m1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得m2代种子。
其次，m2代的种植和选择：将m2代种子按m1代同样的种植方式在氧气体积浓度为12％的28℃co2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；
然后，自交授粉，待座果20d采用大田过茎基部20cm淹水处理2h，确保水位基本淹没所有冬瓜植株茎基部，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体种子mut。
(5)将筛选到的耐涝突变株mut和野生型wt分别催芽后播种于营养钵中，待其长至3叶一心时，分别选取长势一致的幼苗60株进行苗期过茎基部10cm淹水试验，确保水位基本淹没所有幼苗植株茎基部，以诱变处理前dz163冬瓜种子作为野生型wt对照，保持淹水5d，分别取淹水0h、24h、48h、72h和96h的mut和wt进行不定根数量、净光合速率、存活率、丙二醛(mda)、过氧化氢酶(cat)、脯氨酸(pro)、乙醇脱氢酶(adh)和羟自由基(·oh)去除能力等抗氧化酶活等检测。本实验采用9*9cm营养钵进行育苗，商用育苗基质育苗(育苗基质购买于山东省农业科学院园艺研究所)，分别播种100株。脯氨酸(pro)含量测定采用酸性茚三酮法、丙二醛(mda)含量的测定采用硫代巴比妥酸法、可溶性糖含量测定采用蒽酮法、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)、乙醇脱氢酶(adh)、羟自由基(·oh)均采用比色法(试剂盒来自南京建成生物工程研究所)测定，光合作用速率测定采用使用li-6400xt便携式光合作用测量系统测定。实验结果见表2、表3、表4、表5。
表2耐涝突变株mut和wt苗期不同淹水时间下干重及不定根的差异
从表2中可以看出：在淹水0-24h内，耐涝突变株mut和wt的干重、净光合作用、不定根数量、长度以及存活率，差异不大。淹水超过48h之后，耐涝突变株mut开始有一定数量的不定根长出，且存活率为100％，而wt几乎没有长出不定根，而且开始有部分植株死亡。随着淹水时间的延长，耐涝突变株mut不断有不定根长出和变长，96h以后存活率仍达80％以上，而wt只有少量不定根长出，长度明显比耐涝突变株mut短，而且96h以后存活率大大降低，只有46.47％。由此可见，通过本发明方法，诱变和筛选出的冬瓜突变体具有很好的耐涝能力。
表3耐涝突变株mut和wt苗期不同淹水时间下酶活性的差异
(cat/nmolmin-1g-1fw；pod/ug-1fw；adh/μmolmin-1g-1fw)
过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)作为植物体内重要的抗氧化酶，其活性高低能反映植物对逆境胁迫的抵御能力。乙醇脱氢酶(adh)是一种重要的无氧呼吸相关酶，其活性高低反映了植物进行无氧呼吸的能力。从表3中可以看出：淹水前，突变体和野生型的cat、pod和adh酶活性无明显差异；淹水胁迫后，cat、pod和adh酶活性迅速上升；随着胁迫时间的延长，野生型的酶活性缓慢回落，突变体的酶活性却一直能维持在较高水平，且一直显著高于野生型。
表4mut和wt苗期不同淹水时间下mda(nmolg-1fw)和(·oh)清除能力(％)的差异
丙二醛(mda)作为植物体内重要的次级代谢产物，其含量的高低直接反映植物受到逆境伤害的程度。羟自由基(·oh)是植物体中活性氧的一种，其含量越高越易对植物产生伤害。因此，活性氧清除能力的高低也能反映植物对逆境胁迫的抵御能力。从表4中可以看出：野生型随淹水时间的延长，mda含量持续上升，至96h其含量达到81.01nmol/g，为0h的8.57倍；而突变体在淹水24h时其mda含量显著升高，为0h的1.92倍，随后随淹水时间的延长其mda含量无明显上升，且整个淹水胁迫过程中野生型的mda含量均显著高于突变体。随着淹水时间的延长，两材料羟自由基清除能力均不断升高，但均以突变体活性氧清除能力高于野生型。
表5mut和wt苗期不同淹水时间下pro(μgg-1fw)和可溶性糖(mgg-1fw)的差异
脯氨酸(pro)不仅是渗透调节物质，而且还可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂，从而对植物在渗透胁迫下的生长起到保护作用。在逆境条件下，植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。可溶性糖同样存在类似的作用。从表5中可以看出：野生型和突变体的脯氨酸和可溶性糖在淹水后都有不同程度的增加，但突变体的增加量显著高于野生型。
通过对突变型mut和野生型wt冬瓜苗期不同淹水时间下的不定根萌发数量、长度、净光合速率和存活率进行对比以及对其叶片进行过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛、乙醇脱氢酶及羟自由基去除能力等差异分析，结果表明使用本发明方法诱变和筛选出的冬瓜突变体相对于野生型wt的冬瓜种子具有明显较强的的耐涝能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。