一种杂交青花菜的育种方法与流程

本发明涉及一种植物的育种方法，尤其涉及一种杂交青花菜的育种方法。

背景技术：

青花菜(brassicaoleraceavar.italica)又名西兰花，为十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜的一个变种，其体内富含的蛋白质、脂肪、膳食纤维、糖类、胡萝卜素、维生素、钙、磷、铁等营养成分位居同类蔬菜之首，被誉为“蔬菜皇冠”。另外，青花菜还是一种功能性蔬菜，其所含的抗癌活性成分莱菔硫烷，能够显著降低多种癌症的患病率，如肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌等，在预防心脑血管疾病的发生、治疗近视和皮肤再生等方面也有一定的功效。近年来，随着人们对食用方法和营养价值的认识逐步深化，青花菜在国内外市场的需求量逐年加大，出口及内销两旺，在我国蔬菜周年生产面积逐年增加，栽培效益日渐突出，具有十分重要的经济和社会效益。

上世纪九十年代起，由于国外市场对青花菜的需求增加，青花菜产品出口创汇的商机日渐显现，国内开始陆续引进国外品种进行试种生产。随着种植效益的增加，青花菜种植面积也随之扩大，国内部分高校及科研育种单位也逐步开展了青花菜种质资源引进、创新及新品种选育的工作。青花菜起源于地中海沿岸，国内种质资源匮乏，种子价格昂贵，国外优良种质又难以获得，这些不利因素制约着国内青花菜优良品种选育工作的开展。有鉴于此，国内育种单位主要通过与国外种子公司合作，大量引进国外不同类型的由自交不亲和系配制的商品种，通过常规育种手段获得遗传性状稳定的自交系，进而配制出新品种。随着雄性不育性在青花菜育种上应用，市场上的商品种不能再通过自交分离的方式获得自交系育种材料，从而制约了种质资源创新的进一步开展，阻碍了新品种选育的进程。

申请号201210361576.1公开了一种加代选育中早熟青花菜的育种方法，主要是在控温温室中，通过对收集到的青花菜育种材料连续自交和定向选择至少5代获得有利自交系，再经过5代回交选育成胞质雄性不育系，再与优良自交系配制杂交组合，通过田间品比鉴定获得综合性状优良的杂交组合。该方法在实际应用中是可行的，但常规育种手段选育遗传性状稳定的自交系和胞质雄性不育系转育过程至少需要10代，费时费力，效率较低。

技术实现要素：

针对青花菜育种资源匮乏、育种效率低的问题，提出了一种青花菜种质资源创新、胞质雄性不育系材料创制、新品种选育及品比鉴定的育种方法，加速育种进程，提高育种效率，满足生产的需要。为适应市场需求，本申请通过前期青花菜种质资源引进获得的大量纯合稳定自交系为基础，通过不同类型之间杂交获得单交种和双交种，然后从分离后代中优选综合性状优良的单株进行游离小孢子培养，快速获得大量单倍体纯系，染色体加倍后成为dh植株，优选综合性状优良的单株后，与转育获得的胞质雄性不育系材料配制杂交组合，通过在不同栽培条件下进行栽培和品比，综合性状表现优异的组合确定为新品种进行推广应用。本方法提高了育种效率，缩短了新品种选育时间，具有广阔的市场应用潜力。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种杂交青花菜的育种方法，包括以下步骤：

(1)选择综合性状优良的青花菜自交系0812、0836、0858、0887、08103和结球甘蓝胞质雄性不育系cms116，在花期及隔离条件下，将自交系0812与0836杂交、0858与0887杂交、08103与cms116杂交，获得f1-1、f1-2和f1-3杂交一代种子；

(2)将f1-1和f1-2杂交种进行加代种植，即在15-30℃的控温温室中播种育苗，成苗后定植，正常田间管理；在整个生长期间根据植株长势及农艺学性状，剔除生长势弱、花球性状差、抗病性不好的植株，选留综合性状优良的青花菜植株3-5株；在花期，将f1-1和f1-2先自交，然后再进行杂交，获得f2-1、f2-2杂交二代种子和双杂交种子h1；将自交系08103作父本、f1-3作母本进行回交，得到回交一代种子bc1，bc1回交后代中选择与自交系父本08103农艺性状相近的单株作为母本，花期及隔离条件下再与自交系父本08103进行回交，获得的种子播种后，在加代种植条件下经定向选择，继续与自交系父本08103回交6代后，获得与自交父本08103的遗传性状一致的胞质雄性不育系cms08103；

(3)步骤(2)获得的h1种子在15-30℃的控温温室中种植，正常田间管理，在整个生长期间根据植株长势和农艺系性状，选留生长健壮、无病虫害、发育正常、花球圆整的植株3-4株，在花期及隔离条件下自交留种，获得h2种子；

(4)上述获得的f2-1、f2-2和h2种子在15-30℃的控温温室中种植，在生长期间选留综合性状优良的单株进行游离小孢子培养，获得纯合植株群体，观察并筛选出大量综合性状优良的双单倍体系dh；

(5)以步骤(3)中转育获得的青花菜胞质雄性不育系cms08103为母本，以通过小孢子培养获得的dh植株为父本，隔离条件下配制杂交组合，获得一代杂交种；

(6)步骤(5)中获得的一代杂交种经田间种植、品比鉴定，选育出杂交后性能优良的新品种。

作为改进的是，步骤1中综合性状优良的标准为：指的是植株健壮、生长旺盛、抗黑腐病、菌核病和霜霉病、耐寒性好，花球圆整、紧实、蕾粒细且均匀、花球表面颜色灰绿，花器官发育正常、自交结实性好。

作为改进的是，步骤2中bc1回交后代中选择与自交系父本08103形状相近的单株的形状指的是株高、开展度和/或花球性状。

作为改进的是，步骤4中从f2-1、f2-2和h2分离后代中各选择优良单株5-10株进行游离小孢子培养，有利于缩小分离范围，获得的再生植株经0.1％-0.3％人工加倍后，可快速获得遗传稳定的dh系育种材料20-30份。

作为改进的是，步骤5中杂交后性能优良指的是冬性强、耐寒性好、植株健壮、生长旺盛、开展度中等，抗黑腐病、菌核病和霜霉病，花球圆整、紧实、蕾粒细且均匀、花球表面蜡粉含量多、颜色灰绿，雄性不育。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种杂交青花菜的育种方法的优势在于：

1)通过在单交种f2和双交种h2分离后代中优选综合性状优良的植株，在一定程度上淘汰了大部分无效性状基因，缩小了优良性状基因的数量，有利于优良基因聚合；

2)采用游离小孢子培养技术对f2和h2优选单株进行培养，所获得的再生植株群体中综合性状优良表现优良的单株比例较高，从而提高了育种效率，加速了育种进程；

3)采用加代种植的方法，可实现一年两次开花结籽，从而加快了育种进程，提高了育种效率；

4)把综合性状优良的自交系通过回交转育获得胞质雄性不育系，其不育性稳定，不育株率和不育度均达到100％，花器官完整、发育正常，开花结实性好，生长势旺，配合力强；

5)胞质雄性不育系做母本、获得的dh系做父本配制的f1后代也为胞质雄性不育系，有利于保护品种的知识产权；用不育性配制杂交种，种子产量高，制种成本低，省工省力；

6)新种质综合性状优良，杂交后代抗病性、抗逆性显著，增产明显，比传统方法效率提高1倍以上，新品种选育时间缩短2-3年，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明育种方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

江苏丘陵地区镇江农业科学研究所即可提供本发明实施例中所用的全部种子。

本发明中提到的杂交方法为，在播种时需根据不同自交系和不育系生长习性调节花期，当花期不遇时，去除开花较早植株的主花球，促进侧枝发育，花期相遇时，将母株上已开放的花和小的花蕾去除，把第二天即开放的花蕾进行人工剥蕾去雄，涂抹父本花粉，最后整株套袋隔离；

加代种植方法为，所有青花菜育种材料种植在能控制温度、调节湿度、光线充足、施肥浇水方便的温室中，温度能控制在15-30℃，一年可以种植开花2次；

所述双杂交种聚合了4个亲本的优良基因，通过多代自交分离筛选，可成功获得综合性状更加优良、遗传稳定的育种材料。

一种杂交青花菜的育种方法，包括以下步骤：

步骤1、从育种材料中选择植株高度、开展度、叶片和花球表面蜡粉含量、球形及大小、花球无败蕾、结实性好、抗逆性和抗病性强、生长旺盛的青花菜自交系0812、0836、0858、0887、08103和结球甘蓝胞质雄性不育系cms116作为育种材料，于8月20日穴盘播种育苗，9月20日定植到江苏省句容市的亲本圃，正常田间管理。生长期间，剔除弱苗、异株和病株，选留具有该自交系典型性状的植株。翌年开花前一个月左右，天气晴好时割去大部分主花球，刺激其余花枝正常抽生，割后立即在切口处涂抹多菌灵或甲基托布津溶液，以防止植株腐烂。3-4月份开花盛期时，自交系0836、0887和不育系cms116作母本，每株留5-10个枝条，每枝留第二天即将开放的花蕾15-20个并进行人工剥蕾去雄，并将自交系0812、0858和08103(父本)的花粉分别涂抹到已去雄的柱头上，枝条上其余小花蕾和已开放的花均摘除掉，并严格标记，套上硫酸纸袋并扎口后进行隔离。5-6月份收获f1代杂交种，编号分别为f1-1、f1-2和cms-3。

步骤2、将f1-1、f1-2、cms-3和08103在温度控制为15-30℃的温室中进行加代种植。6月中旬，将种子进行春化处理后采用穴盘播种育苗，7月中旬定植，生长温度控制在18-25℃，正常田间管理。9月上旬选留生长旺盛、花球性状好、无病虫害植株各10株，割花球，每株留5-10花枝。9月下旬抽薹开花时，将f1-1株系和f1-2株系在隔离条件下进行人工蕾期和花期自交授粉，得到的种子即为f2-1和f2-2；后选取一株f1-1-1作父本与f1-2-1株作母本在隔离条件下进行杂交，得到的杂交种子为双交种，记为h1。

同时，将cms-3作母本、08103作父本，在严格隔离条件下进行回交，得到的种子为回交一代种子，记为bc1。bc1回交后代中选择与父本08103主要农艺性状，包括株高、开展度、花球性状等最接近的单株作为母本，花期及隔离条件下再与转育父本进行回交，获得的种子播种后，在加代种植条件下经定向选择，继续与转育父本回交6代后，获得与转育父本遗传性状一致的胞质雄性不育系cms08103。

各播种材料如果花期不遇，可去掉开花较早的主枝，促其侧枝发育，调节花期。11月下旬至12月初种子成熟，根据情况单株收种并考种，所获种子标记完后晒干。

步骤3、12月中旬，将f2-1、f2-2和h1的种子经春化处理后采用穴盘播种育苗，第二年1月中下旬将f2-1和f2-2定植300株、h1定植50株。温室内温度控制在18-25℃，正常田间管理。在定植到开花期间，根据植物学性状和农艺性状，拔除弱苗和异株，选留生长势强、花球圆整、球色灰绿、花蕾细且均匀、抗病性和抗逆性好、花蕾发育正常的典型植株，每个株系选择5-10株。3-4月份开花时，选取优良单核晚期至双核早期的花蕾进行游离小孢子培养，青花菜小孢子培养及植株再生方法参见文章‘甘蓝类植物小孢子培养及植株再生研究’(张振超等,核农学报,2013,27(7):0929-0937)，同时对选留的单株进行自交授粉。6月初，根据授粉情况，单株收获成熟的种子。f2单株自交收到的种子记为f3代种子，h1自交获得的种子记为h2。

步骤4、6月中旬将步骤3中获得的种子再次播种，f3代种子各定植150株，h2代定植200株。9月份抽薹开花时，选留下的植株进行人工自交授粉，并选取f3和h2代优选单株的单核晚期至双核早期花蕾进行游离小孢子培养和植株再生试验，方法同上，同时对选留的单株进行自交授粉。12月初，根据授粉情况，单株收获成熟的种子。f3单株自交收到的种子记为f4代种子，h2自交获得的种子记为h3。

步骤5、第三年，把在上述步骤3和4中通过游离小孢子培养技术再生植株在实验室内进行继代和生根培养。8月初，根系生长健壮的组培苗在实验室炼苗1周，8月中旬所有组培苗从组培瓶内小心取出，经0.1-0.3％秋水仙碱溶液处理后移栽到装有蔬菜育苗专用基质的72孔穴盘上，后覆盖黑色遮阳网进行遮阳和保湿。生长15d后，生长健壮、根系发达的6521株植株于9月初定植到大田。在生长期间，依据上述标准对各株系小孢子再生植株群体进行筛选，选留综合性状优良的单株73株。

步骤5、以获得的73株小孢子再生植株为父本、cms08103为母本，配制杂交组合于秋季进行田间鉴定、筛选，配合力测定，最终选育得到综合性状优良的中早熟组合4个，分别为cms08103×md-18、cms08103×md-26、cms08103×md-45和cms08103×md-70。

通过上述选取综合性状优良的自交系，通过遗传育种手段将优良性状基因稳定地遗传给杂交后代，通过在f2和h2代群体中选择聚合了亲本基因的单株，采用高效游离小孢子培养技术快速纯化，从而在短时间内获得73株优良dh株系，并采用加代种植的方法，可实现一年两次开花结籽，从而加快了育种进程，提高了育种效率；通过把综合性状优良的自交系转育成为胞质雄性不育系(表1)做母本、dh系做父本配制杂交种，种子产量高，制种成本低，省工省力，有利于保护品种的知识产权；新种质综合性状优良，杂交后代抗病性、抗逆性显著，增产明显，新组合已在多个地点进行试种(表2)。

表1青花菜胞质雄性不育系cms08103不育系及主要农艺性状

表24个杂交组合主要农艺性状

本发明在申请号201210361576.1的专利基础上，通过在单交种f2和双交种h2分离后代中优选综合性状优良的植株，在一定程度上淘汰了大部分无效性状基因，缩小了优良性状基因的数量，有利于优良基因聚合，采用游离小孢子培养技术分离后，所获得的再生植株群体中综合性状优良表现优良的单株比例较高，从而提高了育种效率，加速了育种进程。