一种阿维菌素纳米缓释体及其制备方法和应用与流程

本发明属于环境友好型纳米农药领域，特别是指一种阿维菌素纳米缓释体及其制备方法和应用。

背景技术：

农药是农业的基本生产资料，能够解决人类基本生存问题，为维护社会稳定提供保障。传统的农药剂型存在有机溶剂含量高、粉尘飘移、分散性差等缺点，导致利用率低下与环境污染。据统计我国自“化肥、农药使用量零增长行动”实施后，农药利用率为36.6%。近年来，农药缓控理论及技术的发展为解决这一问题开辟了新方向，旨在减少农作物对农药的需求，逐步完成更有效、更安全的农药设计，减缓和控制农药释放，选择合适及时的给药途径，以实现准确调控目标害虫。

阿维菌素是灰色链霉菌的微生物发酵产物，含有多种杀虫成分，工业生产中常用超声离心方法为最后的提纯工艺。阿维菌素的第一个特点是高效并能杀死多种害虫，第二个特点是与其他杀虫剂的药性不一样，不易产生抗药性；第三个特点是安全，由于喷到植物表面的药剂能够很快分解，所以对天敌比较安全，对环境少污染。但同时阿维菌素在实际农业应用中的的缺点也十分明显，一是杀虫速率较低，靶标害虫取食后行动迟缓，拒绝取食，2至4天后才死亡；二是原药毒性大，各种成药都以低的有效成分含量来降低药剂的毒性级别，但使用中仍需注意安全；三是生产成本较高。近年研发了一系列含阿维菌素的混合杀虫剂，如与各种菊酯类药剂混用，与毒死蜱混用等等，往往能够起到加速害虫死亡速度；增加触杀或其他作用方式，此外阿维菌素的不稳定性也限制着其药效和有效期。对阿维菌素进行改进有利于阿维菌素的农用开发，延长药效期限，满足高毒农药替代品的开发和研制，具有重要理论意义和现实意义。论文《基于阿维菌素纳米载药体系的构建及缓释行为研究》中公开了阿维菌素与中空纳米sio2载药体系的构建，该载药体系主要是通过二氧化硅纳米微球的吸附作用，其缓释机理不涉及化学反应。

随着纳米材料的发展，几丁质纳米粒子能够实现控制、持续和有针对性地释放药物，同时这些材料本身可生物降解、生物相容，对环境及生物体安全无毒，可以用以药物/农药的传递载体，虽然这类材料在在医学及药学领域研究较多，应用广泛，但在农业中的应用却很少。此外，由于阿维菌素对光、ph和温度等环境敏感，易发生降解而失去药效，在实际农业生产中只有少量有效成分能够达到靶标部位，利用率较低。将农药颗粒并与几丁质结合制备出纳米农药可以减少此类有效成分因光、热、酸碱环境的变化造成的降解和损失，运用这一理论和技术能够达到将阿维菌素与纳米几丁质复合，制备出以及具有生物相容性和可生物降解性，利用效率高且对环境污染小的纳米农药，改善阿维菌素的使用现状。

目前尽管对纳米几丁质在作物害虫防治方面有所研究，但在作物害虫防治上关于纳米几丁质的载药及缓释性能未见报道。申请人经过检索，目前还没有关于纳米几丁质负载农药及负载性能的研究。同时，上述专利中纳米微粒的制备工艺复杂，部分制备反应剧烈，部分使用有机溶剂，不可避免地增加制备成本。因此，在简化制备工艺的同时探索纳米几丁质的农药负载性能，对于有效安全施药，提高农药利用率有重要意义。

技术实现要素：

本发明提出一种阿维菌素纳米缓释体及其制备方法和应用，阿维菌素通过共价结合的方式与纳米几丁质复合成纳米共轭物，具有载药量大，缓释效果明显，热稳定性和光稳定较好，对鳞翅目害虫毒杀效果较好的特性，同时克服了阿维菌素制备条件的限制和易光解的缺陷，主要应用于防治农作物病虫害，对延长阿维菌素的药效期和提高生物利用度具有重要的技术参考。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将几丁质粉末加入浓酸中水浴加热进行酸解，然后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀进行超声处理，得到纳米几丁质，作为载体；

（2）在避光条件下，向阿维菌素原药中加入丙酮助溶，并分散于水中，对分散液进行超声破碎处理，得到纳米阿维菌素；

（3）在避光条件下，将步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质混合，加热条件下进行摇床振荡反应，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得阿维菌素纳米缓释体。

所述步骤（1）中浓酸为浓度2mol/l的盐酸溶液。

所述步骤（1）中水浴温度为40-70℃，酸解时间为1-3h，超声处理的条件为功率100-400w，时间10-60min。

所述步骤（2）中每克阿维菌素原药中加入2-20ml丙酮。

所述步骤（2）中每100ml阿维菌素原药的丙酮溶液，其对应的超声功率为50-300w，超声时间为5-20min。

所述步骤（3）中纳米几丁质与纳米阿维菌素混合的质量比为（1-10）:1。

所述步骤（3）中摇床振荡反应的温度为20-40℃、时间为4-12h。

上述方法所制备的阿维菌素纳米缓释体的颗粒的有效粒径在100至600nm范围内可控。

上述的阿维菌素纳米缓释体在制备农业病虫害防治试剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明制备的纳米缓释体具有缓释效果，提高了阿维菌素的光、热稳定性和分散性能，能够有效提高阿维菌素利用率，延缓阿维菌素释放速率，降低施用量，进而降低农药对土壤及环境的污染和残留状况。

2、本发明制备的纳米缓释体可以通过改变度纳米几丁质与纳米阿维菌素的质量比例而调控缓释体的粒径，进而对阿维菌素的载药量进行调控。本发明的负载纳米阿维菌素的载药颗粒，粒径均一，分散性良好，具有较大的比表面积及其他纳米特性，具有纳米尺寸优势，能够克服叶面沉降阻力，减少有机溶剂的使用，提高对于靶标部位的覆盖率且粘附性好，显著增加纳米阿维菌素与生物膜的接触面积，有助于提高持效期和利用度。同时，所采用载体来源于几丁质，安全无毒可天然降解且造价低。对于提高阿维菌素农药的利用率，提高阿维菌素的杀虫效果，降低阿维菌素农药的使用量、残留及污染具有重要的应用价值。

3、本发明反应条件温和，步骤简洁，对仪器设备要求低，工艺简单，适合大量制备及生产。所采用载体来源于几丁质，安全无毒可天然降解且造价低。对于提高阿维菌素农药的利用率，提高阿维菌素的杀虫效果，降低阿维菌素农药的使用量、残留及污染具有重要的应用价值。

4、本发明在避免了多种有机溶剂的同时克服多种农药的难溶性问题，也为新型绿色安全农药的研制及开发提供了新方法。

5、本发明所制备的纳米几丁质须晶不仅适用于阿维菌素，也适用于其他农药，可应用于作物病虫害防治或综合防治。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4所制得的纳米几丁质颗粒的透射电镜图像。

图2为本发明实施例4所制得的纳米阿维菌素的透射电镜图像。

图3为本发明实施例4所制得的阿维菌素纳米缓释体的透射电镜图像。

图4为本发明实施例4所制得的阿维菌素纳米缓释体在6℃和25℃静置50天的粒径和分散度。

图5为室温下本发明实施例1至实施例5所制得的阿维菌素纳米缓释体的水分散液、纳米阿维菌素、纳米几丁质水分散液的静置60天后的电子图像，其中a为纳米阿维菌素水悬液对照，b为实施例1的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为1:1的纳米缓释体的水悬液，c为实施例2的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为2:1的纳米缓释体的水悬液，d为实施例3的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为4:1的纳米缓释体的水悬液，e为实施例4的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为6:1的纳米缓释体的水悬液，f为实施例5的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为8:1的纳米缓释体的水悬液，g为纳米几丁质水悬液对照，其中a至g的浓度均为5.0mg/ml。

图6为实施例4所制得的阿维菌素纳米缓释体在ph为7.0的水相中的释放曲线。

图7为实施例4所制得的纳米阿维菌素缓释体在ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的pbs缓冲液中的持续释放率。

图8为实施例4中所制得的阿维菌素纳米缓释体与阿维菌素原药、几丁质粉末、纳米几丁质的红外光谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以70℃水浴加热，酸解2h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以300w的功率超声处理60min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以100w的功率超声破碎处理10min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液。阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：15ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:1混合，30℃加热条件下以摇床振荡反应8h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施例2

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以40℃水浴加热，酸解1h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以100w的功率超声处理10min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以200w的功率超声破碎处理10min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液。阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：5ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:2混合，40℃加热条件下以摇床振荡反应8h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施例3

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以55℃水浴加热，酸解3h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以400w的功率超声处理30min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以300w的功率超声破碎处理20min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液。阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：10ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:8混合，40℃加热条件下以摇床振荡反应12h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施例4

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以70℃水浴加热，酸解2h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以300w的功率超声处理60min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以300w的功率超声破碎处理10min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液。阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：10ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:8混合，30℃加热条件下以摇床振荡反应4h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

图1为本实施例制得的纳米几丁质颗粒的透射电镜图像，从图中可以看出，纳米几丁质呈晶体状，粒径为100至500nm，颗粒均匀且分散性好，无团聚出现。

图2为本实施例所制得的纳米阿维菌素的透射电镜图像，从图中可以看出，纳米阿维菌素呈球状，粒径为20至80nm，颗粒均匀且分散性好。

图3为本实施例中所制得的阿维菌素纳米缓释体的透射电镜图像，从图中可以看出，纳米阿维菌素全部或部分包裹在纳米几丁质的外表面，阿维菌素纳米缓释体呈梭形，粒径为100至600nm，颗粒均匀且分散性好。

图4为本实施例中所制得的阿维菌素纳米缓释体在6℃和25℃静置50天的粒径和分散度，从图中可以看出，将纳米阿维菌素缓释体分散在6℃和25℃的水相中，经过50天的自然静置，有效粒径在600nm范围内，即在纳米尺度范围，颗粒有效粒径没有明显变化。此外，分散度虽增加，但都保持在0.637以内，表明稳定性和分散性良好。

图5为本实施例1至5所制得的阿维菌素纳米缓释体在水相中室温静置60天的电子图像，从图中可以得出，经过室温静置后，并没有出现沉淀分层现象，缓释体的水分散液稳定可靠。

图6为本实施例所制得的阿维菌素纳米缓释体在ph为7.0的水相中的释放曲线，从图中可以看出，相比于阿维菌素和纳米阿维菌素，阿维菌素纳米缓释体表现出一个0至8h的快速释放过程和紧接着的缓慢释放过程，但总释放量随时间不断增加，高于阿维菌素的总释放量，且相比于阿维菌素具有明显的缓释效果。

图7为本实施例所制得的纳米阿维菌素缓释体在ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的pbs缓冲液的持续释放率，结果显示缓释体在pbs缓冲液中对纳米阿维菌素的累计释放率与ph的大小成负相关，即ph越高，累计释放率越低，这可以解释为纳米几丁质均为加热与酸解的制备过程中，使得几丁质结构中脱乙酰基暴露出氨基，在酸性低于其本身pka的条件下发生质子化继而转化为铵根，在水分散相中表现为带正电荷，水相中ph越低酸性越高时，未被纳米阿维菌素占用的纳米几丁质颗粒表面的正电荷相互排斥越强，使得缓释体结构疏松，较易发生溶胀，使得缓释体易于释放纳米阿维菌素。

图8为本实施例中所制得的阿维菌素纳米缓释体与阿维菌素原药、几丁质粉末、纳米几丁质的红外光谱图。从图中可以看出，纳米几丁质与阿维菌素的复合物在3430cm^-1处的吸收为o-h键的振动，在3095cm^-1处的吸收为n-h键的对称收缩，而在1658、1557、1310cm^-1处的振动归属于几丁质的c=o键和c-n-h键的变形振动，分别为几丁质的酰胺ⅰ的变形振动、酰胺ⅱ的碳氮振动和酰胺ⅲ的变形振动。而在894cm^-1处的吸收为β-1,4糖苷键中c-h的轴向振动，在1734cm^-1处的吸收为阿维菌素振动吸收的典型吸收峰，且显示在高脱乙酰度和低脱酰度复合物，此外，缓释体在测试中没有新峰的出现，这均表明纳米几丁质对纳米阿维菌素的成功负载且负载稳定有效。

实施例5

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以70℃水浴加热，酸解2h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以100w的功率超声处理60min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以150w的功率超声破碎处理20min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液。阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：15ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:10混合，20℃加热条件下以摇床振荡反应12h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施例6

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以70℃水浴加热，酸解2h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以100w的功率超声处理10min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以300的功率超声破碎处理15min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液，阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：10ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:9混合，30℃加热条件下以摇床振荡反应8h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施例7

本实施例的一种阿维菌素纳米缓释体的制备方法，步骤如下：

（1）将1g几丁质粉末加入50ml浓度为2mol/l的盐酸溶液中以40℃水浴加热，酸解3h后将混合液离心得到沉淀，并对沉淀以100w的功率超声处理20min，得到纳米几丁质，用作载体。

（2）在避光条件下，将阿维菌素原药加入丙酮中助溶，并分散于水中，对分散液以50的功率超声破碎处理20min，得到纳米阿维菌素颗粒的水分散液，阿维菌素与丙酮的比例优选地采用1g：2ml。

（3）在避光条件下，将上述步骤（2）得到的纳米阿维菌素与步骤（1）得到的纳米几丁质按质量比为1:10混合，40℃加热条件下以摇床振荡反应4h，得到纳米阿维菌素与纳米几丁质缓释体的水分散液，真空冷冻干燥后即得到缓释体的固体颗粒。

实施效果例

实施例1至实施例5所制得的阿维菌素纳米缓释体的水分散液、纳米阿维菌素、纳米几丁质水分散液的静置60天后的电子图像见图6，从左至右依次a为纳米阿维菌素水悬液对照，b为实施例1的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为1:1的纳米缓释体的水悬液，c为实施例2的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为2:1的纳米缓释体的水悬液，d为实施例3的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为4:1的纳米缓释体的水悬液，e为实施例4的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为6:1的纳米缓释体的水悬液，f为实施例5的纳米几丁质与纳米阿维菌素质量比为8:1的纳米缓释体的水悬液，g为纳米几丁质水悬液对照，其中a至g的浓度均为5.0mg/ml。从图中可以看出，经过长时间静置后，所有分散液均未出现沉淀分层，表明所制备的纳米几丁质、纳米阿维菌素及阿维菌素纳米缓释体具有良好的稳定性和悬浮性。

将实施例1-5的制备参数及制备得到的阿维菌素纳米缓释颗粒的性能对比表

表1实施例1至5的制备参数水平及纳米缓释体的特性对比

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由表1可得出可以通过改变度纳米几丁质与纳米阿维菌素的质量比例而调控缓释体的粒径，进而实现对纳米阿维菌素的载药量进行调控。

在pbs缓冲液中，不同ph下的释放曲线表明，纳米缓释体在酸性缓冲液中释放速率较快，在弱碱性悬浮液中释放速率较慢。沿着纳米几丁质主链分布的-nh³⁺暴露在弱酸性悬浮液中，在弱酸性悬浮液中动态释放，有助于纳米颗粒的分散，以及负载在纳米几丁质表面的纳米阿维菌素颗粒的物理吸附和静电吸附。

在纳米缓释体的制备过程中，纳米阿维菌素富集在纳米几丁质颗粒的外表面，当载药颗粒进入水相中时，其表面以附着和吸附方式及共价结合饱和度较低的阿维菌素颗粒迅速分散到水相介质，农药颗粒释放速率较快，因此形成一个快速释放过程。随后对于每个缓释体颗粒，其微环境及酸碱度的改变能够破坏共价键，使之发生异裂，弱酸弱碱根可逆性的与阿维菌素竞争几丁质表面暴露出来的氨基，并逐步达到平衡，导致几丁质颗粒表面的农药颗粒根据浓度差以渗透方式缓慢释放出来，形成了在此后的缓慢释放直至平衡的过程。

此外，农药释放的速率和程度与浓度梯度有关，当大部分农药颗粒释放出来以后，纳米缓释体表面上与水相中的农药浓度梯度逐步降低，此时，农药释放动力不足，释放速率降低，导致最后一小部分农药颗粒不能脱离几丁质表面，导致释放率不能达到100%。但在实际应用条件下，阿维菌素在长期内随着几丁质的降解和分解，颗粒最终能脱离几丁质表面并释放出来。

综上所述，本发明所制备的纳米阿维菌素颗粒由于其有效粒径在100至600nm，比表面积较大，因而相比于阿维菌素能够充分发挥纳米农药的小尺寸优势，克服疏水性农药的叶面沉降阻力，减少有机溶剂和助剂的使用，对于靶标具有更大的覆盖率且粘附性好，能够显著增加农药与生物膜的接触面积，从而达到长持效期和高利用度。

本发明制备的纳米阿维菌素缓释体粒径均一，分散性良好，具有较大的比表面积，同时具有缓释效果，且相比于常规阿维菌素，具有较显著的纳米农药特性。同时所选用的几丁质载体安全无毒，具有可降解性，材料来源广泛。本发明对于提高阿维菌素农药的利用率，提高阿维菌素的杀虫毒力，降低阿维菌素农药的使用量、残留及污染具有重要的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。