一种南高丛越组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种南高丛越组培快繁方法。
【背景技术】
[0002]越橘属于杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木，果实为蓝色或红色，原产北美。果实为蓝色或红色，果实大小因种类不同而异，果肉柔软多汁，风味醇美，含有丰富的维生素和及其他果品中少有的特殊营养成分，具有较高的保健药用价值，因此国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一。我国的越橘属植物资源非常丰富，但集中栽培面积还较少，主要集中分布于大、小兴安岭和长白山等地。越橘苗木繁殖方法因品种而异，高丛越橘主要釆用硬枝扦插，兔眼越橘采用绿枝扦插，矮丛越橘硬枝扦插和绿枝扦插均可，其他方法如种子育苗、根状茎扦插、分株等也有应用，但这些繁殖方式均存在周期长、繁殖系数低、成本高等质点，限制了快速繁殖及新品种选育等工作。而离体培养可弥补传统繁殖方法的不足，在较短时期内扩大繁殖优良品种，并能利用遗传转化技术在短期内培育新品种。
[0003]越橘是一种新兴栽培果树，蕴藏着巨大的发展潜力，由于越橘鲜果的总量很少，所以在国际市场上售价昂贵。而南高丛越橘(Kaccifliw? aiAstraJe)具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点，具有巨大的市场潜力。因此，加速南高丛越橘的发展有着广阔的前景。但南高丛越橘作为一种木本观赏果树的植物，在传统的种子繁殖受到产量低、难度高、所需时间长、生长环境受限等条件的限制下，因此，急需建立了系统的南高丛越橘组织培养植株再生体系，以提高其繁殖速度和规模，从而实现南高丛越橘种苗的工厂化生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种南高丛越组培快繁方法，本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种南高丛越组培快繁方法，包括以下的步骤:
(O外植体消毒:采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗I?3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升汞溶液消毒3?8min，用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用O
[0006](2)诱导培养:将经步骤(I)处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在25?28°C条件下全暗培养10?20天，然后置于每天光照10?16小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成丛生芽。培养2周后统计污染率、启动率和死亡率。
[0007](3)增殖培养:将步骤(2)生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?7天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽。
[0008](4)生根培养:将步骤(3)获得的生长至1.5?2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至生根。
[0009](5)炼苗移栽:根长至I?2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2?4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷=3:1:1组成基质中并定植于大田中，移栽I个月内保持空气湿度80%以上。
[0010]上述诱导培养基为:WPM+0.1 ?2.0mg/L ZT+1.0 ?4.0mg/L 6-BA+0.1 ?1.0mg/L NAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的增殖培养基为::WPM+0.1?2.0mg/L ZT+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上步骤(4)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0?3.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/LABTi+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]与现有技术相比本发明的优点是:南高丛越橘(Vaccinium australe)实有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点。越橘在自然状态下以二倍体、四倍体或六倍体形式存在，但由于越橘的杂种杂合性，使得采用传统育种手段进行越橘育种既费吋又费力。因此，很有必要建立南高丛越橘离体再生体系，为高品质、高产量、适应性强的南高丛越橘的培育奠定基础。本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，以期为越橘大量繁殖提供新的快速有效途径。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1
(O外植体消毒:采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒20s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒9min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0016](2)诱导培养:将经步骤(I)处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在27°C条件下全暗培养12天，然后置于每天光照14小时，光照强度为30001x，置于培养温度为27°C的条件下培养，诱导率为78.56%。所述的诱导培养基为:WPM+1.5mg/L ZT+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+18g/L 蔗糖 +3.6g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0017](3)增殖培养:将步骤(2)生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在27°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为40001x，培养温度为27°C的条件下培养，每20天继代一次，增殖系数为4.6。所述的增殖培养基为::WPM+2.0mg/L ZT+20g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0018](4)生根培养:将步骤(3)获得的生长至1.5?2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为40001χ，培养温度为27°C的条件下培养直至生根，生根率为76.93%。所述的生根培养基为:l/2MS+2.8mg/LNAA+1.0mg/L ABI\+2.8g/L 蔗糖 +4.9g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0019](5)炼苗移栽:根长至I?2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷=3:1:1组成基质中并定植于大田中，移栽I个月内保持空气湿度80%以上，移栽成活率为90.37%。
实施例2
(O外植体消毒:采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒15s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0020](2)诱导培养:将经步骤(I)处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导。接种后先在25°C条件下全暗培养10天，然后置于每天光照13小时，光照强度为20001x，置于培养温度为25°C的条件下培养，诱导率为83.47%。所述的诱导培养基为:WPM+1.2mg/L ZT+2.4mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+18g/L 蔗糖 +3.6g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0021](3)增殖培养:将步骤(2)生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照13小时，光照强度为30001x，培养温度为25°C的条件下培养，每20天继代一次，增殖系数为4.3。所述的增殖培养基为::WPM+1.8mg/L ZT+25g/L 蔗糖 +4.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0022](4)生根培养:将步骤(3)获得的生长至1.5?2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照13小时，光照强度为50001χ，培养温度为25°C的条件下培养直至生根，生根率为79.27%。所述的生根培养基为:l/2MS+3.0mg/LNAA+1.5mg/L ABT-Og/L 蔗糖 +5.0g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0023](5)炼苗移栽:根长至I?2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷=3:1:1组成基质中并定植于大田中，移栽I个月内保持空气湿度80%以上，移栽成活率为88.49%ο
【主权项】
1.一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体消毒:采集南高丛越健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗I?3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升汞溶液消毒3?8min，用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用; (2)诱导培养:将经步骤(I)处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行丛生芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养10?20天，然后置于每天光照10?16小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成丛生芽，培养2周后统计污染率、启动率和死亡率； (3)增殖培养:将步骤(2)生长健壮的南高丛越橘丛生芽转接至继代培养基中进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?7天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽； (4)生根培养:将步骤(3)获得的生长至1.5?2.5cm丛生芽从基部剪切并接种至生根培养中诱导生根，接种后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001χ，培养温度为25?28°C的条件下培养直至生根； (5)炼苗移栽:根长至I?2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2?4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷=3:1:1组成基质中并定植于大田中，移栽I个月内保持空气湿度80%以上。
2.根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:WPM+0.1 ?2.0mg/L ZT+1.0 ?4.0mg/L 6-BA+0.1 ?1.0mg/L NAA+15 ?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L琼脂，pH为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤(3)所述的增殖培养基为:WPM+0.1?2.0mg/L ZT+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L琼脂，pH为5.4?5.8ο
4.根据权利要求1所述的一种南高丛越组培快繁方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0 ?3.0mg/L NAA+1.0 ?2.0mg/L ΑΒ?\+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
【专利摘要】本发明公开了一种南高丛越组培快繁方法，南高丛越橘（Vaccinium australe）具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点。因此，很有必要建立南高丛越橘离体再生体系，为高品质、高产量、适应性强的南高丛越橘的培育奠定基础。本发明以南高丛越橘带芽茎段为外植体，通过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了南高丛越橘离体再生植株，从而实现了南高丛越橘组培快繁，以期为越橘大量繁殖提供新的快速有效途径。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104719157
【申请号】CN201510099597
【发明人】朱远星
【申请人】朱远星
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月6日