枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平 板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
[0023] 4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马 丁氏培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养3-5 d。
[0024] 5) 1. 3. 3. 2平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化。直到培养基上长出来的是纯种，如不纯，仍需重复该步骤，最后得到3个菌种。
[0025] 1.3. 4强化耐冷微生物的鉴定 按照试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10XBuffer(with MgCl2)2 μL，dNTP (10mmol/L)0.4pL，341f (1〇μπιο1/1)?μL，534ι· (10Mmol/L)lPL，Taq 酶（5u/>L) 0. 4μL，模板DNAIPL，加超纯水定容至终体积2〇μL。PCR反应条件：94°C 5min 预变性，94°0变性11^11，55°0复性458,72°0延伸458,30个循环，72°0延伸1〇1^11。引物为 34If (5，-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和 534r (5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。优势真菌的 PCR 反应体系： IOXBuffer (without MgCl2)2 μL,MgCl2 (25mmol/L)l. 6μL, dNTP (10mmol/L)0. 4μL,GeolI (l〇Mmol/L) 0· 4μL，GeoA2 (l〇Mmol/L) 0· 4μL，Taq 酶（5u/>L) 0· 2μL，模板 DNA ?μL，加超纯 水定容至终体积2〇μL。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C变性lmin，54°C复性lmin， 72°C延伸 2min，30 个循环，72°C延伸 7min。引物为 GeoA2 (5' -CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3')和 Geoll (5' -ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。将得到的 PCR 产物送到 北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
[0026] 对上述分离纯化出的菌种通过菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似 度）比较，鉴定结果如下表
【主权项】
1. 一种采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法，其特征在于按如下 的步骤进行： (1) 将土壤基质在121°C下灭菌30min备用，3〇-35nm纳米堆肥以混施的形式施入； (2) 在实验室内进行草坪植物栽培试验，实验时基质用量为9400gnT2,草皮基质厚度为 15 mm，高羊茅草种播种量为160gnT2,首先将晾干后的土壤与纳米肥料按体积比59 :1的比 例混合灭菌； (3) 灭菌后取一半土肥平铺培养皿，加入强化耐冷微生物菌剂15ml，所述的强化耐冷微 生物菌剂指的是：假单胞菌、枯草芽孢杆菌、和隐球菌按体积比1: 1: 1:1的 比例配制； (4) 然后覆盖另一半土肥，基质铺好后进行播种，首先将种子浸泡24h后均匀播洒于基 质表层，进行黑暗处理，充分浇水保证萌发，萌发后进行光照培养，期间早晚定期浇一次水， 定期测定植株高度，生长30d后测定高羊茅的生物量及叶绿素含量，试验期间光照强度为 360-650ymol.iiT2.s' 相对湿度为 40-50%，温度为 18-230C; (5) 测定完上述指标后再次分别加入15ml耐冷复合微生物菌剂，然后将植株进行低温 过度处理，过度期的温度为5-12°C，过度持续一周，去掉高羊茅中的干草、烂草、枯草，然后 将高羊茅剪至4cm，浇足越冬水之后进行越冬，越冬期间温度为-8°C- -10°C，越冬35d后移 入室内进行返青处理，培养一段时间后进行返青率和各项指标的测定。
2. 权利要求1所述采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法，其 中：（1)纳米堆肥的制备：将生活垃圾堆肥105°C烘干至恒重，将垃圾堆肥加工研磨制成 3〇-35nm纳米堆肥，备用； (2) 低温胁迫实验共设3个处理，4次重复，三个处理分别为： 1) 以100% 土壤为对照基质并加入15ml空白培养基 2) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml空白培养基 3) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml强化耐冷微生物菌剂 (3) 将土壤基质在121°C下灭菌30 min备用，纳米堆肥以混施的形式施入，在实验室内 进行草坪植物栽培试验，实验时基质用量为9400gnT2,草皮基质厚度为15 mm，高羊茅草种播 种量为160gm2,首先将晾干后的校园土与纳米肥料按比例混合灭菌，灭菌后取一半土肥平 铺培养皿，加入复合微生物菌剂15ml，然后覆盖另一半土肥，基质铺好后进行播种，首先将 种子浸泡24h后均匀播洒于基质表层，进行黑暗处理，充分浇水保证萌发，萌发后进行光照 培养，期间早晚定期浇一次水，定期测定植株高度，生长30d后测定高羊茅的生物量及叶绿 素含量，试验期间光照强度为360-650 y mol.HT2. s-1，相对湿度为40-50%，温度为18-23 °C ; (4) 测定完上述指标后再次分别加入15ml耐冷复合微生物菌剂和空白培养基， 然后将植株进行低温过度处理，过度期的温度为5-12°C，过度持续一周，去掉高羊茅中 的干草、烂草、枯草，然后将高羊茅剪至4cm，浇足越冬水之后进行越冬，越冬期间温度 为-8°C- -KTC，越冬35d后移入室内进行返青处理，培养一段时间后进行返青率和各项指 标的测定。
3. 权利要求1所述采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法，其中： 涂布在相应的培养基上指的是：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基和马丁氏培养基。
4. 权利要求1所述采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法在提高 高羊茅生长方面的应用。
5.权利要求1所述采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法在促进 高羊茅返青时间方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种采用耐冷强化活性纳米垃圾堆肥增强草坪草抗低温的方法。它是将强化微生物菌剂联合纳米堆肥施用于草坪基质中，研究其对草坪植物株高、生物量、绿度及越冬返青情况的影响，目的为低温条件下草坪建植，提高草坪植物抗寒性。实验结果显示：在低温条件下，接种强化微生物联合纳米堆肥高羊茅的株高、生物量、叶绿素都明显高于未接种的高羊茅，并且强化微生物联合纳米堆肥处理组高羊茅的返青时间提早了7天，返青率与对照相比高出了118.57%。因此强化微生物菌剂联合纳米堆肥，作为一种具有微生物活性的高效肥料，在提高草坪植物抗寒性及低温条件下的草坪建植具有重要意义。
【IPC分类】A01G1-00, A01C21-00
【公开号】CN104838843
【申请号】CN201510186592
【发明人】多立安, 赵树兰, 刘春湘
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月20日