抗病原体方法
【专利说明】
[0001] 申请数据
[0002] 本申请与2012年11月23日提交的名称为"Anti-pathogenicmethods"的美国 临时申请No. 61/729, 467有关并要求其优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容教导了保护植物以及人和非人对象免受病原体之害。本公开内容能够 以多价方式抑制植物以及人和非人动物对象中的病原体感染，减少对易感性对象的损伤。
【背景技术】
[0004] 在说明书的结尾以字母顺序收录了由本申请的作者引用的出版物的文献详情。
[0005] 本说明书中对任何现有技术的引用没有也不应视为承认或以任何形式暗示该现 有技术形成了任何国家公知常识的一部分。
[0006] 由植物病原体（例如真菌和昆虫病原体）的感染造成的作物损失是农业产业中 的主要问题，每年要花费数百万美元来施用杀真菌剂控制这些损失（Oerke和Dehne(2004) CropProtection23 :275-285)。需要鉴定新的抗植物病原体策略。特别重要的是考虑病 原体出现抗性的倾向。人和非人对象的真菌感染还可导致显著不适和严重的健康问题。病 原真菌对于人类健康和经济也是严重问题。人类真菌病原体造成威胁生命的医院获得性疾 病，其具有高死亡率和较不严重的表面感染。
[0007] 植物已经进化成产生肽来保护免受病原体。其特异性可能受到响应于对多种病原 体暴露的进化的影响。
[0008] 植物防卫素代表了一类抗病原体分子。存在多种防卫素，其具有不同的空间和时 间表达模式和活性谱。通常，植物防卫素可分为两大类类防卫素由内质网（ER)序列接 成熟防卫素结构域组成。II类防卫素作为较大前体产生，除了ER信号序列和成熟结构域外 还具有约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽（CTPP)。
[0009] 对于这些肽的特异性背后的机理尚未完全阐明，但是推测包括与质膜组分的相互 作用。由于膜透化是许多抗病原体肽的共同活动，并且多种细胞类型的膜组成高度可变，假 设在一些情况下存在特定脂质来负责抗病原体肽的效力。
[0010] 植物病原体引起显著的植物产量损失，目前用于病原体控制的策略很昂贵并且可 能破坏环境。考虑到对改善农业生产的经济的需求，需要新的策略来保护农业植物和重要 的观赏植物免受多种疾病，尤其是真菌性疾病。病原性（pathogenic)真菌还严重关系到人 类健康和经济。目前的疗法需要长期治疗方案，患者通常遭受到相关的肝毒性。对于目前 疗法的抗性也形成了建立新疗法的需求。
【发明内容】
[0011] 贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语"包括"或变化形式如"包含"或"含 有"应理解为意指包括述及的要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组，但 是不排除任何要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组。
[0012] 如本说明书中使用的，未用数量词限定的名词包括单数和复数方面，除非上下文 另外明确指出。因此，例如，提到"透化防卫素"包括单一透化防卫素，以及两种或更多种透 化防卫素；提到试剂包括单一试剂，以及两种或更多种试剂。提到"本发明"包括本公开内 容教导的单个或多个方面。能够使本发明的所有方面均在权利要求的范围内。
[0013]核苷酸和氨基酸序列由序列标识符编号（SEQIDNO)指示。SEQIDNO在数字上 对应于序列标识符<400>1(SEQIDN0:1)、〈400>2(SEQIDN0:2)等。在表1中提供了对 序列标识符的总结。
[0014] 本文公开了用于减少病原体（例如真菌和昆虫）对作物和观赏植物造成的损失的 方法。常规控制方法包括施用化学杀真菌剂。这增加了作物和花丼生产的成本。根据本公 开内容，在I类防卫素和透化防卫素之间鉴定到了令人惊讶的协同效应，导致提高了在预 防和减轻植物的真菌和昆虫疾病状态中的效力。所述方法还能够治疗或预防人和非人动物 对象中的病原体感染。提到的"I类"防卫素包括透化防卫素和非透化防卫素。因此，可使 用一种或更多种透化防卫素。提到的"透化防卫素"包括I类防卫素、II类防卫素和是透化 防卫素的变体防卫素。"变体"防卫素包括这样的防卫素，其中II类防卫素的环IB区被I 类防卫素上的环IB区替换或者通过其他方式对II类环IB区进行一个或更多个氨基酸替 换、添加或缺失。环IB区域位于防卫素N末端部分（也称为第一柔性环）上的第一 0链 (0链1)和a-螺旋之间。
[0015]如上所述，植物防卫素可分为两大类。I类防卫素由内质网（ER)信号序列接着成 熟防卫素结构域组成。II类防卫素作为较大前体产生，除了ER信号序列和成熟结构域外还 具有约33个氨基酸的C末端前结构域或前肽（CTPP)。
[0016]按照观察到的由两种防卫素的组合引起的真菌生长抑制％ (Io值）和两种防卫 素基于每种防卫素自身的真菌生长抑制％之和的预期真菌生长抑制％ (根据Richer等 (1987)PesticSci19 :309-315使用的Limpel公式计算的Ee值）之间的差对协同作用分 类。差Io-Ee是协同值。小于15的协同值均意味着没有显著协同，15-30是低协同水平， 30-60是中等协同水平，> 60是高协同水平。
[0017] 因此，本公开内容教导了保护植物免受与病原体感染有关的疾病的方法，所述方 法包括向细胞提供I类植物防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、 类似物、衍生物或变体。在一个实施方案中，植物病原体是真菌。在另一个实施方案中，植物 病原体是昆虫。在一个方面，提到的"植物"包括遗传修饰的植物，所述遗传修饰的植物含有 产生I类防卫素和透化防卫素的细胞，其中在遗传修饰之前细胞不产生任一种防卫素。提 到的"植物"包括遗传修饰的植物的后代，其包含因亲本的遗传修饰而产生一种或另一种或 两种防卫素的细胞。因亲本的遗传修饰导致产生两种防卫素，并且传递给后代的这种性状 赋予了在不产生两种防卫素的植物中观察不到的对真菌或昆虫病原体的抗性水平。I类防 卫素可以是透化防卫素或非透化防卫素。本公开内容还教导了保护人或非人动物对象免受 与病原体感染有关的疾病的方法，所述方法包括向细胞提供I类植物防卫素和透化防卫素 或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。在一个实施方案中，病原 体是真菌。提到的非人动物对象包括农场动物（例如，牛、羊、猪、马、驴、美洲驼、羊驼、禽类 动物）、家养动物（例如，狗、猫）、实验室测试动物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、非人 灵长类动物）和捕获的野生动物。
[0018] 术语"遗传修饰"意指通过DNA重组技术对植物或植物细胞进行遗传修饰以引入 编码两种防卫素的遗传物质。或者，使用这种技术引入编码至少一种防卫素的遗传物质，并 使用常规育种引入另一种防卫素基因。
[0019] 在一个实施方案中，I类防卫素是透化防卫素。在另一个实施方案中，I类防卫素 是非透化防卫素。在一个实施方案中，第二透化防卫素选自I类防卫、II类防卫素或变体 防卫素。
[0020] 本公开内容实现了用于保护植物免受真菌或昆虫病原体感染和/或降低严重的 真菌或昆虫病原体相关疾病之发病率的方法。本公开内容还可用于将植物和/或其周围根 系或土壤的真菌或昆虫感染降低至可接受水平。所述方法包括使用至少一种I类防卫素和 一种透化防卫素的组合的多价方式。后者透化防卫素的实例是I类防卫素、II类防卫素或 变体防卫素。变体防卫素教导在PCT/AU2012/000112中，其内容通过引用并入本文。出人 意料地，给定的I类防卫素和给定的透化防卫素的的联合作用对于给定的真菌或昆虫病原 体是协同的，即，当（至少）两种组分在植物环境中组合时，其抗病原体活性大于任一种防 卫素单独作用的抑制效果的总和。协同的水平各不相同（Thelevelofsynergyisfrom lowtohigh)〇
[0021]因此，本公开内容教导了用于保护保护植物免受与真菌或昆虫病原体感染有关的 疾病的方法，所述方法包括以协同有效量向所述植物的细胞提供I类防卫素和透化防卫素 或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体以减少病原体的感染。
[0022] 本发明上下文提到的"方法"包括植物管理系统、方案和流程。如上所述，在一个 实施方案中，病原体是真菌病原体。在另一个实施方案中，病原体是昆虫病原体。
[0023] 提到的"向植物的细胞提供"包括提供来自外源的两种防卫素，或者从细胞内（通 过遗传修饰）提供它们二者，或者外源提供一种并且细胞内提供一种。因此，可使用局部施 用和遗传改造并且任选地还包括常规育种以使遗传植物暴露于两种防卫素。本文还实现了 包含两种防卫素的组合的局部种子包衣，或者向改造为表达另一种防卫素的植物或植物种 子局部施用一种防卫素。
[0024] 本文还实现了用于保护人或非人动物对象免受与真菌或昆虫病原体感染有关的 疾病的方法，所述方法包括以协同有效量向人或非人动物的细胞提供I类防卫素和透化防 卫素或者其一或两者的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体以减少病原体的感染。
[0025] 本公开内容还预期了I类防卫素和透化防卫素或者其一或两者的前体形式在制 造对真菌或昆虫感染较不敏感或展示出较少真菌或昆虫感染相关损伤的遗传修饰植物中 的用途。
[0026] 本公开内容还预期了I类防卫素和透化防卫素或者其一者或两者的前体形式在 制造用于治疗人或非人动物对象中的真菌感染的药物中的用途。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供了用于保护作物或观赏植物免受真菌或昆虫攻 击的方法，其包括向所述植物提供I类防卫素和透化防卫素或者其功能同源物、类似物或 变体或等同物。在该实施方案中，与每种单独组分的各自效果的组合相比，认为两种组 分的真菌或昆虫抑制程度是协同的。在一个实施方案中，通过至少一种I类防卫素和至 少一种透化防卫素的组合协同抑制镰刀菌属（Fusarium)的种。I类防卫素的实例包括 hordothionin(y1-H)、zeathionin(y-Zea2)、PsDl、DmAMPl、SBI6、VP42、VP45、VP135、RsAFP2、MsDefl、MtDef2、MtDef4、HsAFPl、VaD2、VrD2、ZmESR6 和HXL防卫素（参见表 2)。 透化防卫素的实例包括NaDI、TPP3、PhDIA、PhD2、HXLOOI、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、 HXP4、HXP34和HXP35以及N〇D173(参见表2)。所述方法还可额外包括使用蛋白酶抑制 剂或其前体形式，例如半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶抑制剂（例如，马铃薯StPinlA[以前称为 PotlA(美国专利No. 7,462,695)])、HvCPI6、SICys9、At2g38870、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)或牛胰蛋白酶抑制剂I-P。单独地对系统的每一种组分的抑制敏感的任何真菌或昆 虫均可使用组合以比使用任一种组分本身更有效地控制。特别有用的组合包括HXP4、NaDl、 HXL004、HXLOOl和 / 或HXL008 作为透化防卫素，HXL012、HXL015、SB16、HXL009、HXL008 和 /或HXL021作为I类防卫素。
[0028] 本公开内容还提供了保护植物免受与真菌或昆虫病原体感染有关的疾病的方法。 所述方法包括向植物细胞提供I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂，或者这 些组分的任意一种或全部的前体或其功能同源物、类似物、衍生物或变体。
[0029] 本发明方法的多价方式包括一起协同作用的I类防卫素和透化防卫素，或者还包 含蛋白酶抑制剂或其前体形式。这些组分可通过重组手段在植物细胞中产生，或者可局部 地向植物细胞提供，例如作为喷雾、气雾剂、粉末的形式，或作为肥料或植物养料的一部分。 如上所述，在另一个选择中，一种组分通过重组手段提供，另一种组分外源提供。本文还实 现了局部种子包衣剂（seedcoatings)。将两种防卫素施用到种皮中，或者将一种防卫素局 部施用到已改造为表达另一种防卫素的植物或种子。在一个实施方案中，通过基因工程手 段提供一种或另一种防卫素，并通过常规育种提供另一种防卫素。
[0030] 本文教导的另一个方面是用于抑制真菌或昆虫生长、复制、感染和/或保持的方 法，所述方法包括使真菌或昆虫暴露于I类防卫素和透化防卫素的组合。还可使用蛋白酶 抑制剂或其前体形式。这适用于植物以及人和非人动物对象。
[0031]另外，同与组合暴露所使用相同剂量的任一种组分单独接触真菌所提供的抑制的 总和相比，在两种防卫素存在下的真菌或昆虫抑制的程度是协同性的。
[0032] 如果每一种组分单独对真菌或昆虫发挥抑制活性，或者组合中的组分发挥协同的 组合抑制效果，则真菌或昆虫是对系统的每一种单独组分"抑制敏感"。
[0033] 基于是否嵌合防卫素被认为是I类防卫素或透化防卫素或它们二者，也可将保留 抗真菌活性的嵌合防卫素分子和/或防卫素变体用在用于本发明的植物保护方法中。
[0034]本文还实现了多基因表达载体（MGEV)，其包含具有2至8个结构域区段的多核 苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个结构域编码I类防卫素并且至少一个另 外的结构域编码透化防卫素，每个结构域在线性序列中通过接头序列与下一个结构域相 连，所述接头序列编码具有SEQIDNO:86所示出的氨基酸序列的接头肽。MGEV载体在 USSN2007-0277263中公开，其内容通过引用并入本文。
[0035] 在一个实施方案中，至少一个另外的结构域编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。
[0036] 接头肽包含氨基酸序列X1X2X3X4XJSEQIDNO:86)，其中：
[0037]X1= E 或D
[0038]X2= E 或D
[0039] X3= K或R
[0040]X4= 1(或1?
[0041]X5=N或Q。
[0042] 本公开内容还教导了I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂或者这 些组分的任意一种或全部的功能同源物、类似物、衍生物或其变体在制造抗真菌或昆虫病 原体感染的遗传修饰植物或其后代中的用途。
[0043] 本公开内容还教导了I类防卫素和透化防卫素以及任选地蛋白酶抑制剂或者这 些组分的任意一种或全部的功能同源物、类似物、衍生物或变体在使人或非人动物对象或 其后代抵抗真菌或昆虫病原体侵袭方面的用途。
[0044]可用在本发明方法的实施方案中的蛋白酶抑制剂包括但不限于半胱氨酸蛋白酶 抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。
[0045] 可通过本发明方法保护免受真菌或昆虫感染的植物包括对真菌或昆虫敏感的那 些植物，或者可向其施用包含防卫素和蛋白酶抑制剂的组合物的那些植物，所述真菌或昆 虫对可在所述植物中作为转基因表达的蛋白酶抑制剂和植物防卫素敏感。本文还预期了组 合转基因和局部施用的方式。"局部施用方式"包括种子包衣剂。蛋白酶抑制剂通常是蛋白 质或肽或其化学类似物。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。具体植物包括玉米（玉蜀 黍）、大豆、棉花、加拿大油菜和小麦等，以及茄科、十字花科、锦葵科和豆科植物。
[0046]可使用本发明系统控制多种植物物种中的来自多种真菌病原体的感染和损 伤，尤其是丝状真菌的那些。可控制的真菌和卵菌病原体的实例包括但不限于镰刀菌 属、轮枝孢属（Verticillium)、腐霉属（Pythium)、丝核菌属（Rhizoctonia)、核盘菌 属（Sclerotinia)、小球腔菌属（Leptosphaeria)、疫霉属（Phytophthora)、炭疽菌属 (Colletotrichum)、尾孢属（Cercospora)和链格孢属（Alternaria)的种以及锈菌D重要 应用包括但不限于蛋白酶抑制剂和抗真菌防卫素的协同组合，其用于例如保护植物免受 以下真菌：禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum，Fgr)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum，Fov)、禾生炭疽菌（Colletotrichumgraminicola，Cgr)、十 字花科小球腔菌（Leptosphaeriamaculans)、甘蓝链格抱菌（Alternariabrassicicola)、 互隔交链抱霉菌（Alternariaalternata)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、灰霉病 菌（Botrytiscinerea)、甜菜生尾抱（Cercosporabeticola)、玉米尾抱（Cercospora zeaemaydis)、异方定腔抱菌（Cochliobolusheterostrophus)、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum)、大刀镜刀菌（Fusariumculmorum)、尖抱镜刀菌（Fusariumoxysporum)、尖抱镜 刀菌石竹专化型（Fusariumoxysporumf.sp.dianthi)、尖孢镰刀菌番前专化型（Fusarium oxysporumf.sp.Iycopersici)、腐皮镜刀菌（Fusariumsolani)、小麦冠腐病菌（Fusarium pseudograminearum)、轮枝镜抱菌（Fusariumverticilloides，Fve)、禾顶囊壳小麦变种 (Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、芸臺丰艮月中菌（Plasmodiophorabrassicae)、核 盘菌（Sclerotiniasclerotiorum)、玉米干腐病菌（Stenocarpella(Diplodia)maydis)、 根串珠霉（Thielaviopsis匕&8；[(301&)、大_ 轮枝菌（Verticilliumdahliae)、玉米黑 粉菌（Ustilagozeae)、玉米柄锈菌（Pucciniasorghi)、菜豆壳球抱菌（Macrophomina phaseolina)、大豆垄褐腐病菌（Phialophoragregata)、大豆垄溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum)、大豆灰斑病菌（Cercosporasojina)、大豆疫霉菌（Phytophthorasojae)、 立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani)、豆薯层锈菌（Phakopsorapachyrhizi)、大抱链格 抱（Alternariamacrospor