一种铁皮石斛种胚的直播方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体是一种铁皮石斛种胚的直播方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛是传统珍稀名贵中药材，在《道藏》中被列为“中华九大仙草之首”。铁皮石斛具有滋阴清热、生津益胃、提高人体免疫力等功效，具有很高的药用价值。因其种子发育不完全，无胚乳，其自然萌发需要恰当的环境以及共生菌的帮助，对自然条件要求苛刻，自然条件下的萌发率极低，现铁皮石斛野生资源已濒临灭绝。
[0003]目前，药用铁皮石斛种植所需苗种是通过现代植物组培技术培育而来。我国的植物组培技术发展于20世纪50年代，在石斛行业中的应用研宄起源于20世纪80年代，近十年内组培技术在石斛繁育中得到了快速发展，但与此同时问题也逐渐显露，组培行业技术要求高，投资大，条件要求苛刻，风险可控性不强，导致种苗的价格昂贵，种植户难以接受，加之非专业人员的盲目投资导致组培苗种的品种、品质良莠不齐，种植成活率不高，往往对广大种植户造成较大损失，严重影响农户种植的积极性，阻碍石斛行业的健康发展。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种简单实用、稳定可靠、可操作性强的铁皮石斛种胚的直播方法，经该方法直播播种的铁皮石斛种胚，其萌发率可达86.2%以上，株高大于3cm的铁皮石斛苗的移栽成活率可达97.9%以上。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种铁皮石斛种胚的直播方法，包括以下步骤:
O直播种子的选择:选择完全成熟的铁皮石斛果荚作为直播种子；
2)共生菌培养液的制备:选取带有部分原始基质的野生铁皮石斛，将其根部连带原始基质浸泡在无菌水中40?60min，浸泡期间每3?5min摇晃一次，浸泡结束后得到浸泡液；将得到的浸泡液在150?200rpm转速下离心处理40?80s沉降杂质，取上清液并将上清液在3000?4000rpm转速下离心处理10?15min，弃上清后向离心管中加入2?3mL无菌水后漩涡震荡45?60s，得到菌液；将得到的菌液接种于马铃薯蔗糖液体培养基中，每10mL马铃薯蔗糖液体培养基接种80?120 μ L菌液，于30?38°C在转速为120?150rpm的培养箱中培养3?5d后收获共生菌培养液；
3)直播基质的选择及处理:选取发酵过的粒径为0.2?2.0cm的松鳞作为直播基质，并将松鳞铺至苗床，然后向苗床浇灌制得的共生菌培养液一次，之后每7?1d用共生菌培养液喷雾处理一次，前后处理时间为45?60d ；
4)直播种子的预处理与播种:将选择的直播种子用70?75%的酒精进行表面消毒8?1min,然后切开种子果荚并将种胚倒入含萘乙酸0.6?0.8mg/L、6_苄氨基嘌呤0.2?0.4mg/L、椰汁8?10%的无菌液中，保证平均每颗种胚用800?1200mL的无菌液进行暗处理，处理时间为12?15h，得到种子混合液；向得到的种子混合液中加入制得的共生菌培养液，保证平均每升种子混合液用80?120mL的共生菌培养液进行暗处理，暗处理4?6h后，得到种子处理液；向经喷雾处理的苗床喷洒种子处理液，按照每平方米苗床喷洒0.05-0.15L种子处理液进行直播播种；
5)播种后期管理:控制播种后的种子培养环境的温度为20?30°C、空气湿度为70?90%，种子播种后每7?1d喷用一次制得的共生菌培养液，同时播种后头7?1d进行暗处理，之后的一个月内光照强度控制在1500?2000LUX，待叶片萌发至株高3cm后进行移栽和正常的水肥管理。
[0006]步骤2)中所述的马铃薯蔗糖液体培养基的pH值为6.0，该培养基含有马铃薯200g/L、蔗糖 30g/L 和麸皮 20g/L。
[0007]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明采用人工培育的共生菌培养液处理直播基质和直播种子，使直播种子在人工仿野生环境下自然萌发，最终组培得到铁皮石斛苗，解决了铁皮石斛直播萌发条件苛刻和萌发率极低的问题，为铁皮石斛的人工培育提供了一条新途径。本发明方法简单实用，稳定可靠，可操作性强，成本低廉，经本发明方法直播播种的铁皮石斛种胚，其萌发率可达86.2%以上，株高大于3cm的铁皮石斛苗的移栽成活率可达97.9%以上，可大幅降低种植户的成本投入，满足铁皮石斛大规模种植的需要，符合铁皮石斛产业化生产需求，对石斛行业的可持续发展具有极其重要的意义。
【具体实施方式】
[0008]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009]实施例一的铁皮石斛种胚的直播方法，包括以下步骤:
1)直播种子的选择:选择购自浙江温州的100%成熟的铁皮石斛果荚作为直播种子；
2)共生菌培养液的制备:选取带有部分原始基质的浙江野生铁皮石斛，将其根部连带原始基质浸泡在无菌水中40min，浸泡期间每3min摇晃一次，浸泡结束后得到浸泡液；将得到的浸泡液在150rpm转速下离心处理60s沉降杂质，取上清液并将上清液在3000rpm转速下离心处理12min，弃上清后向离心管中加入2mL无菌水后漩涡震荡45s，得到菌液；将得到的菌液接种于马铃薯蔗糖液体培养基(含有马铃薯200g/L、蔗糖30g/L和麸皮20g/L，pH值为6.0)中，每10mL马铃薯蔗糖液体培养基接种90 μ L菌液，于30°C在转速为120rpm的培养箱中培养5d后收获共生菌培养液；
3)直播基质的选择及处理:选取发酵过的粒径为1.0?1.5cm的松鳞作为直播基质，并将松鳞铺至苗床，然后向苗床浇灌制得的共生菌培养液一次，之后每7d用共生菌培养液喷雾处理一次，前后处理时间为49d ；
4)直播种子的预处理与播种:将选择的直播种子用70%的酒精进行表面消毒8min，然后切开种子果荚并将种胚倒入含萘乙酸0.6mg/L、6-苄氨基嘌呤0.2mg/L、椰汁8%的无菌液中，保证平均每颗种胚用100mL的无菌液进行暗处理，处理时间为12h，得到种子混合液；向得到的种子混合液中加入制得的共生菌培养液，保证平均每升种子混合液用10mL的共生菌培养液进行暗处理，暗处理4h后，得到种子处理液；向经喷雾处理的苗床喷洒种子处理液，按照每平方米苗床喷洒0.1L种子处理液进行直播播种；
5)播种后期管理:控制播种后的种子培养环境的温度为20?30°C、空气湿度为70?90%，种子播种后每7d喷用一次制得的共生菌培养液，同时播种后头7d进行暗处理，之后的一个月内光照强度控制在1500?2000Lux，45d后萌生出第一片叶片，萌发率为86.2%，株高3cm后进行移栽和正常的水肥管理，移栽成活率为97.9%。
[0010]实施例二的铁皮石斛种胚的直播方法，包括以下步骤:
O直播种子的选择:选择购自广西桂林的100%成熟的铁皮石斛果荚作为直播种子；
2)共生菌培养液的制备:选取带有部分原始基质的桂林野生铁皮石斛，将其根部连带原始基质浸泡在无菌水中50min，浸泡期间每4min摇晃一次，浸泡结束后得到浸泡液；将得到的浸泡液在180rpm转速下离心处理60s沉降杂质，取上清液并将上清液在3500rpm转速下离心处理lOmi