品；
[0031] (2)以文冠果叶片为材料，以公知任意一种方法提取其RNA，并采用RNA-Seq技术 进行RNA测序，然后根据序列搜索简单重复序列，共检测到10652个SSR标记序列；
[0032] (3)采用Primer Premier 5. 0软件设计特异引物：参数为：引物长度（20~ 24nt)、3'端稳定性（-6. 0 ~-9. Okal/mol)、引物 Tm值（55 ~60°C )、GC 含量（45 ~55% )、 引物rating值> 90。以2个不同文冠果种质的DNA为模板，进行PCR扩增，根据聚丙烯酰 胺垂直凝胶电泳结果，选取能扩增出条带、位点条带清晰，且有多态性的引物对，共筛选出 32对SSR标记引物，见表1 ;
[0033] (4)利用步骤（3)筛选出的32对SSR标记引物分别对步骤（1)提取得到的文冠果 DNA进行PCR扩增，扩增产物利用8 %聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测；
[0034] (5)以电泳检测结果条带的有无进行计数，有记为"1"，无记为"0"，利用 NTYsys2. 0软件计算Nei氏遗传距离；
[0035] (6)将Nei氏遗传距离分为8个级别范围，分别为0. 20-0. 25,0. 26-0. 30、 0· 31-0. 35、0· 36-0. 40,0· 41-0. 45,0· 46-0. 50,0· 51-0. 55 和 0· 56-0. 60 ;在每个 Nei 氏遗传 距离级别内，以2个不同文冠果种质互为授粉树，设计7个授粉组合，如下表2 ;每个授粉组 合采用人工异交授粉处理，每个组合处理200朵花；
[0036] (7)对不同的授粉处理，分别在人工授粉处理后的第20天统计结实率（结实 率=果实数/授粉处理花数X 100% )，第60天统计坐果率（坐果率=坐果数/结实 数X 100% )，结果见表2 ;
[0037] 表1文冠果Nei遗传距离检测的32对SSR标记引物
[0038]
[0040] 表2不同授粉组合的结实率和坐果率 [0041 ]
[0042]
[0043] 由表2知，Nei氏遗传距离范围0. 36-0. 40的文冠果授粉组合为最佳，异交授粉的 结实率和坐果率分别达87%和63%以上，极大的提高了文冠果的结实率和坐果率。
[0044] 二、检测文冠果自然栽培群体交配系统
[0045] 在文冠果自然栽培群体中，选取5个样方，样方大小均在2亩以上，果实成熟期，每 个样方内随机选取40个单株，每个单株距离在IOm以上，收集单株果实。每个样方随机选 择30个单株，对其种子进行混匀，随机选择其中的25粒种子用于DNA提取。
[0046] 利用表1所示32对SSR标记引物，对5个样方内125个DNA样品进行PCR扩增； 扩增产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测；以条带有无进行计数，有记为"1"，无记 为 "0"。
[0047] 利用MLTR3. 2软件估算文冠果自然栽培群体单位点异交率（ts)、多样点异交率 (tj和双亲近交系数（k-tj、亲本近交系数（F)和多位点相关度（r pni)，见表3。
[0048] 表3文冠果自然栽培群体交配系统
[0049]
[0050] 由表3知，文冠果自然栽培群体异交率较高，介于0.968到0.986之间。5个文冠 果群体的多位点异交率都高于单位点异交率，而且位点亲本相关度比较小，说明群体内不 存在近交。同时，各群体单位点相关度与多位点相关度差值较小，表明群体内不存在亚结 构。
[0051] 三、确定高异交传粉配置格局
[0052] 阜新蒙古族自治县文冠果种质基地内，在文冠果盛花期，选取不同株行距的文冠 果样方，对文冠果的访花昆虫、访花昆虫行为及其活动规律进行了观测，在观察开花、散粉 及访花者的访花频率的同时观测风力、记录天气情况。结果见表4。
[0053] 如表4所示：高异交传粉发生率的株行距为ImX I. 5m，株行距为ImX I. 5m的同一 传粉者不同单株花间访花频率为〇. 032次/min，同株异花被同一传粉者访问频率为0. 007 次/min ;但株行距为2mX4m的同一传粉者不同单株花间访花频率仅为0. 005次/min，同株 异花被同一传粉者访问频率为〇. 013次/min。因此，早期密植有利用文冠果异交传粉发生， 并降低同株异花授粉和自交传粉的发生，。
[0054] 表4不同株行距文冠果传粉者活动规律
[0055]
[0056] 依据授粉组合及高异交传粉发生率的株行距，设计"优良无性系+高配合力+高异 交传粉配置格局"的文冠果丰产营林模式。在这种模式中，选择Nei氏遗传距离介于0.36 到0. 40之间的文冠果种质，人工异交结实率在87 %以上，坐果率在63 %以上，设计株行距 为ImXL 5m，可有效增加异交传粉，实现文冠果产量提高，解决了文冠果千花一果的问题。
【主权项】
1. 一种文冠果丰产营林的分子设计方法，其特征在于，由以下顺序的步骤组成： (1) 选择不同文冠果种质，分别提取其DNA ; (2) 筛选适用于文冠果的SSR标记引物； (3) 利用筛选出的SSR标记引物，计算不同文冠果种质间的Nei氏遗传距离； (4) 将Nei氏遗传距离划分为8个级别，在每个级别内，以不同文冠果种质互为授粉树， 设计不同的授粉组合，分别进行人工授粉； (5) 在人工授粉后的第20天统计并计算结实率，第60天统计并计算坐果率；得到配合 力最佳的文冠果种质； (6) 以步骤（5)得到的配合力最佳的文冠果为种质材料，设计文冠果丰产营林模式。2. 如权利要求1所述的一种文冠果丰产营林的分子设计方法，其特征在于，所述步骤 (1)提取DNA的方法为改良CTAB法。3. 如权利要求1所述的一种文冠果丰产营林的分子设计方法，其特征在于，步骤（6)所 述文冠果丰产营林模式，文冠果的株行距为ImXL 5m，种质组合间的Nei氏遗传距离范围 为 0? 36-0. 40。
【专利摘要】本发明涉及一种文冠果丰产营林的分子设计方法，该方法主要包括三个主要步骤：(1)通过SSR分子识别方法确定最佳的文冠果授粉组合；(2)检测文冠果自然栽培群体交配系统；(3)确定高异交传粉配置格局。通过本发明提供的SSR分子识别方法得到的配合力最佳文冠果授粉组合的Nei遗传距离范围为：0.36-0.40，结实率和坐果率分别达87％和63％以上，并与高异交传粉配置格局结合，极大的提高了文冠果的结实率和坐果率，解决了文冠果千花一果的问题。
【IPC分类】A01H1/02, C12Q1/68, A01H1/04, A01G1/06
【公开号】CN105009951
【申请号】CN201510509114
【发明人】阮成江
【申请人】大连民族大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月18日