一种文冠果丰产营林的分子设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过分子识别设计文冠果的营林格局，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 文冠果属无患子科文冠果属，是我国特有的落叶小乔木或灌木，1属1种。昆虫 传粉的文冠果花为雌雄同株，雄花的雌蕊退化，雌花的花粉囊不开裂。文冠果坐果率非常 低，通常小于5 %，在果树中非常罕见，故称"千花一果"，其主要原因是文冠果存在自交不 亲和的现象。发明人进行控制授粉试验，对比研究结果表明，文冠果自交结实率为〇%、同 株异花授粉结实率为2. 79%、开放授粉结实率为9. 47%、异花授粉结实率为17. 97% ;而 文冠果花大而多，昆虫传粉的传粉方式易造成同花自交授粉和同株异花授粉。为解决"千 花一果"问题，我国学者在文冠果传粉（田英等，黑龙江农业科学，2013,（6) :50-55)、开 花结实（郭冬梅等，北方园艺，2013,（6) :21-23)、落花落果（柴春山等，植物研究，2012， 32(1): 110-114)、雄花雌蕊败育、雌花雄性不育的蛋白和基因表达、激素调控花性别与保花 保果（汪智军等，吉林农业科学，2013, 38 (1) : 58-61)、优良无性系选择等方面开展了大量 研究，并取得了一定进展，如文冠一号、文冠二号、文冠三号、文冠四号、中淳一号和中淳二 号等优良品种的选育。但未见利用文冠果的自交败育机制获得自交恢复系以提高文冠果产 量的报道。
[0003] 到目前为止，未见利用Nei氏遗传距离与花粉流设计高异交传粉配置格局的丰产 营林技术的相关专利。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明以不同文冠果种质为材料，根据不同种质间的Nei氏遗传 距离设计不同的授粉组合，并根据不同授粉组合的结实率和坐果率优选出最适种质组合， 再以高异交传粉配置格局设计营造丰产林，实现文冠果产量提高，为文冠果产业提供技术 依托。本发明的技术方案如下：一种文冠果丰产营林的分子设计方法，由以下顺序的步骤组 成：
[0005] (1)选择不同文冠果种质，分别提取其DNA ;
[0006] (2)筛选适用于文冠果的SSR标记引物；
[0007] (3)利用筛选出的SSR标记引物，计算不同文冠果种质间的Nei氏遗传距离；
[0008] (4)将Nei氏遗传距离划分为8个级别，在每个级别内，以不同文冠果种质互为授 粉树，设计不同的授粉组合，分别进行人工授粉；
[0009] (5)在人工授粉后的第20天统计并计算结实率，第60天统计并计算坐果率；得到 配合力最佳的文冠果种质；
[0010] (6)以步骤（5)得到的配合力最佳的文冠果种质为材料，设计文冠果丰产营林模 式。
[0011] 进一步的，所述步骤（1)提取DNA的方法为改良CTAB法。
[0012] 进一步的，所述步骤（2)筛选SSR标记引物的方法包括如下步骤：
[0013] 1)利用RNA-Seq技术开发文冠果的SSR标记序列；
[0014] 2)采用Primer Premier 5. 0软件设计特异引物：参数为：引物长度（20~24nt)、 3'端稳定性（-6. 0~-9. Okal/mol)、引物Tm值（55~60°C )、GC含量（45~55% )、引物 rating值> 90。以不同文冠果种质的DNA为模板，进行PCR扩增，根据聚丙烯酰胺垂直凝 胶电泳结果，筛选出SSR标记引物。
[0015] 进一步的，所述步骤（6)文冠果丰产营林模式，文冠果的株行距为ImXL 5m，种质 组合间的Nei氏遗传距离范围为0. 36-0. 40。
[0016] 本发明根据利用SSR标记检测不同文冠果种质间的Nei氏遗传距离选配出最适的 授粉组合：Nei氏遗传距离为0. 36-0. 40的种质授粉组合为最佳，异交授粉的结实率和坐果 率分别达87%和63%以上，以高异交传粉配置格局成功实现文冠果丰产营林模式，为我国 大面积建设文冠果经济能源林，发展文冠果产业提供了丰产营林的技术基础。
[0017] 本发明的有益效果如下：
[0018] (1)本发明的分子识别方法操作简单，易推广扩大使用；
[0019] (2)使用本发明方法提供的分子识别方法，筛选出Nei氏遗传距离范围0. 36-0. 40 的授粉组合为最佳，异交授粉的结实率和坐果率分别达87%和63%以上，极大的提高了文 冠果的结实率和坐果率，解决了文冠果千花一果的问题；
[0020] (3)本发明提供文冠果丰产营林模式，为我国大面积建设文冠果经济能源林，发展 文冠果产业提供了丰产营林的技术基础。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但这不限制本发明的范围，实施例以 阜蒙和通辽文冠果种质基地的6个文冠果品种和50个文冠果优良无性系为材料。文冠果 品种分别为：文冠 1号、文冠 2号、文冠3号、文冠4号、中淳1号和中淳2号；优良无性系分 别为：FM1、FM2、FM4、FM5、FM6、FM7、FM8、FM10、FM12、FM13、FM14、FM15、FM16、FM17、FM19、 FM21、FM22、FM23、FM24、FM25、FM26、FM27、FM28、FM29、FM33、FM36、FM37、FM40、FM41、FM43、 FM48、FM50。NaAc 溶液的浓度为 3mol/L，PH 为 5. 2。
[0022] 实施例1
[0023] -、选择最佳的文冠果授粉组合
[0024] (1)以6个文冠果品种和50个文冠果优良无性系为材料，利用改良CTAB方法分别 提取其DNA，步骤如下：
[0025] 1)将文冠果叶片10克放入研钵，倒入适量液氮研磨后，移入预先加有700 μ L 2XCTAB的离心管中，置于65°C水浴处理45~60min，离心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液I ;
[0026] 2)取步骤1)离心管中上清液I 600 μ L于新离心管中，加入总体积为600 μ L的 酸、氯仿和异戊醇混合液（体积比为25 :24 :1)，摇勾后离心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液II ;
[0027] 3)取上清液II 550 μ L于离心管中，加入500 μ L 10XCTAB，摇匀后置于65°C水浴 中溶解2~3min，再加入总体积为50 μ L的酸：氯仿：异戊醇混合液（体积比为25 :24 :1)， 摇勾后离心（4°C，lOOOrpm，IOmin)，得上清液III ;
[0028] 4)取上清液III加入其体积2倍的无水乙醇，再加入其体积1/10的NaAc溶液，静置 2小时以上，得沉淀；
[0029] 5)将步骤4)所得沉淀洗涤后烘干，烘干温度为37°C，时间为8~IOmin ;
[0030] 6)将步骤5)烘干后的沉淀溶解后常温静置2小时，即得文冠果DNA样