半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及半夏疏松愈伤组织诱导、继代增殖 及半夏人工种胚分化培养的方法。
【背景技术】
[0002]半夏[/YfleWiateraate(Thunb.)Breit.]，又称麻芋果、三步跳、三片叶、燕子 尾等，是天南星科半夏属的一种多年生草本药用植物，在我国广泛分布（除内蒙、黑龙江、吉 林、青海、新疆、西藏外，其余省份均有分布)。半夏是一种大宗药材，以其块茎入药，味辛苦、 性温、有毒，具有燥湿化痰、降逆止呕等功效，对降压、凝血、抗生育等也有一定作用。200多 种中成药中含有半夏。
[0003] 随着对半夏研究的深入，其药用价值逐渐体现出来，药用量逐年上升，加上野生资 源不集中、采挖难度大等导致半夏市场供不应求。因此，半夏的人工种植经济效益高，市场 前景广阔。人工种植虽在一定程度上缓解了半夏药材的供需矛盾，但因其亩用种量大、连作 病害频繁、种质退化严重等因素，致使多数药农对半夏种植望而却步。半夏组织培养技术的 成功虽为解决半夏繁殖和种质创新提供了新的途径，但组培苗栽种工作量大、管理程序繁 琐、成活率低，故该项技术在半夏规模化种植中实用意义不大。
[0004] 人工种子技术的出现为半夏种子规模化生产和种质提纯复壮带来了希望。其中， 半夏人工种胚同步化培养是该项技术的核心，也是关系到半夏人工种子规模化生产能否实 现的关键环节，对解决半夏规模化人工种植中所需大量优质种子种苗问题具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种通过液体悬浮培养获得半夏同步化人工种胚的方法，为 实现半夏人工种子规模化生产提供保障。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：首先以半夏无菌苗叶片或叶柄作为外植体诱导产生 愈伤组织，然后通过调整继代培养基及继代次数获得适于悬浮培养的疏松愈伤组织，再经 悬浮培养建立半夏微细均一细胞团悬浮体系，最后通过对植物生长调节物质种类和浓度、 蔗糖浓度、水解酪蛋白（CH)浓度及光照强度的调节，构建优化的半夏人工种胚同步化培养 条件。
[0007] 具体步骤如下： 步骤1 :采用半夏无菌苗叶片或叶柄作为外植体，置于MS添加2, 4-D1. 0~2. 0 mg/L 和6-BA 0. 5~1. 5 mg/L的固体培养基上，诱导获得愈伤组织； 步骤2 :选择步骤1中增殖较快、疏松程度较高的愈伤组织，以MS为基本培养基，添加 2, 4-D0? 5~2. 0mg/L和6-BA0? 5~1. 5mg/L进行继代增殖培养，每隔25~30d继代 1次，连续继代3次后获得适于悬浮培养的颗粒状离散愈伤组织； 步骤3 :挑选步骤2中增殖快、疏松程度高的愈伤组织，以不含蔗糖和琼脂的MS液体培 养基添加 2, 4-D0? 5 ~1. 5mg/L+ 6-BA0? 2 ~1. 0mg/L+CH100 ~300mg/L+ 蔗糖 30~50g/L进行悬浮培养，每隔10~15d继代1次，连续继代3次后获得适于进行人工 种胚膨大培养的细胞团； 步骤4:选择步骤3中继代3次后生长良好的细胞团，以MS+ 6-BA0. 5mg/L+CH300mg/L+蔗糖30g/L液体培养基为基础培养基，分别添加不同浓度的植物生长调节物 质2, 4-D0~0. 5mg/L、NAA0~0. 5mg/L、IBA0~2. 0mg/L进行细胞团膨大培养，培养 10 d左右可形成大量乳白色、质地紧密、直径约0.1 cm的细胞团； 步骤5 :将步骤4中的细胞团进行过筛处理，滤去单细胞和疏松细胞团，选取质地紧密、 大小均一的微细胞团，置于MS+CH300mg/L+鹿糖10g/L再添加6-BA0~2.0mg/L、 IBA0~0. 2mg/L的液体培养基中进行分化培养，10~15d后分化形成可用于制作半夏 人工种子的大量同步化人工种胚。
[0008] 作为优选方案，所有培养基pH均调节为5. 8,培养温度为（25 ± 1) °C，光照强度 2000lx，光照时间12h/d，悬浮培养基不含琼脂，特殊情况另加说明。
[0009] 作为优选方案，步骤1中诱导疏松愈伤组织的外植体为半夏无菌苗叶片，诱导愈 伤组织的植物生长调节物质为2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA1.5mg/L;或外植体为半夏无菌苗 叶柄，添加植物生长调节物质为2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA1.0mg/L。
[0010] 作为优选方案，步骤2中愈伤组织继代增殖培养基为MS+ 2, 4-D2.0mg/L+ 6-BA1. 0mg/L〇
[0011] 作为优选方案，步骤3中愈伤组织悬浮培养基为MS+ 2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA 0.5mg/L+CH300mg/L+ 鹿糖 40g/L，黑暗培养。
[0012] 作为优选方案，步骤4中选择增殖快、分散程度高、性状呈圆形或卵圆形的细胞 团，悬浮培养基为MS+ 6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+CH300mg/L+ 蔗糖 30g/L。
[0013] 作为优选方案，步骤5中细胞团悬浮培养基为MS+ 6-BA0.5mg/L+IBA0.05 mg/L+CH300mg/L+ 鹿糖 10g/L。
[0014] 本发明达到的有益效果： 由于传统的半夏人工种植采用块茎繁殖，成本高、病害严重。本发明成功建立了半夏人 工种胚同步化悬浮培养方法，突破了半夏人工种子规模化生产的关键技术环节，从而为解 决半夏种子用量、种质提纯复壮并实现半夏药材规范化、规模化人工种植提供了有效途径。
【附图说明】
[0015] 图1为半夏人工种胚的诱导形成过程。图中：A:外植体(叶片）;B:初代愈伤组织； C:3次继代后的愈伤组织；D:细胞团悬浮系；E:膨大培养的细胞团；F:分化形成的人工种 胚。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0017] 实施例1 :愈伤组织诱导及继代培养 实施例中的材料半夏[/YfleWia teraate (Thunb.) Breit.]采自贵州赫章县。
[0018] 选取长势好的半夏无菌苗叶片或叶柄作为外植体，以MS为基本培养基，采用外植 体、2, 4-D、6-BA三因素三水平正交实验设计进行愈伤组织诱导培养。培养条件：温度（25 ± 1) °C，光照强度2000lx，光照时间12h/d。统计愈伤组织诱导率及其鲜重(表1)。
[0019] 从表1可知，不同处理组合对半夏愈伤组织诱导率影响不大，但对形成愈伤组织 多少、愈伤组织颜色和质地等影响较大。结论：将叶片接种于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L或叶柄接种于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L培养基上（培养基pH为 5. 8,下同)，诱导出的愈伤组织长势较好且疏松。
[0020] 通过调整2, 4-D及