一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物育种领域，涉及一种高效快速构建植物突变体库的方法，尤其涉 及一种通过理化诱变剂复合诱变（r射线和甲基磺酸乙酯（EMS))高效快速创制沿阶草饱和 高抗同质突变体库的优化方法。
【背景技术】
[0002] 沿阶草又名麦冬（Ophiopogon japonicus)，有三个种，沿阶草（Ophiopogon bodinieri.);矮生沿阶草（Ophiopogon japonicus f. nanus)和黑沿阶草 (0· japonicus (L. f. )Ker-Gawl·)，均属于百合科沿阶草属。沿阶草是我国特有的观叶多年 生常绿草本地被植物，因其植株低矮，具强喜荫性，抗病抗虫性好，终生免修剪等特性，而作 为许多地方理想的观叶地被植物或园林绿化中的构景植物；沿阶草还具有药用性，其块根， 常为滋阴中药，《神农本草经》列为上品，还是"药食同源"品种，其丰富的多糖和高异黄铜 类化合物在保健食品的开发方面也有大量的应用。沿阶草野生种质资源在我国非常丰富， 生产上主要以开发利用为主，研究方面主要集中在组培快繁方面，近年来随着开发力度的 增大，其品种改良不断得到重视，其特有的一些生物学性状如矮生性、强耐荫性、药理活性 和化学成分的分析研究等也不断得到加强，使得它成为寻找某些有重要利用价值的基因如 矮生基因、耐荫基因和控制多糖和高异黄铜类化合物等基因资源发掘利用的典型材料。所 以创建沿阶草突变体库，不但对于进行大规模、高通量的沿阶草功能基因组研究意义重大， 还对加速获得具有自主知识产权的重要基因（外可用于鉴定和分离基因，内可用于筛查特 殊基因）和培育优质、耐逆性强、生态安全性高的沿阶草新品种具有重要的战略意义；同 时，也为沿阶草正向遗传学和功能基因组学分析提供丰富的研究材料，具有重要的现实意 义。
[0003] 目前模式植物拟南芥、水稻等作物均已构建了饱和突变体库并进行了相关功能基 因组学的研究，获得了一批有重要价值的创新种质资源。随着新技术和新方法在植物功能 基因组研究中的发展完善，高效快速大规模地创制与品质、抗逆性等密切相关的同质突变 体库已成为很多植物某类特定功能基因组学研究或如抗寒遗传学、分子生物学机理等非常 重要的材料，目前有关沿阶草饱和高抗同质突变体库的创建国内外均未见报道。
[0004] 利用化学或物理诱导剂获得突变体是目前许多植物构建突变体库的主要方法。因 其操作简便，产生的突变可随机分布于整个基因组、密度高，成本低，特别适宜于饱和突变 体库的创制，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。
[0005] 在众多理化诱变剂中，甲基横酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS)和6°C〇-y射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生 多个点突变，且分布均匀，有利于等位基因突变体的获得，特别是其较小的突变群体便可获 得饱和的突变体库；而r射线主要引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族 基因功能缺失的突变体库的创建。所以如果这两种方法结合在一起使用，即通过一种复合 诱变方法，不但通过优势互补，增加突变体库的容量，还能满足对饱和突变体库的要求。目 前两种方法相结合一起使用构建植物突变体库还未见报道，尤其是利用两种方法相结合构 建沿阶草饱和突变体库国内外未见报道。
[0006] 在理化诱变后及时使用选择压力对基因突变的细胞进行筛选可在一定程度上实 现定向诱变，也可以发展为定向诱导基因组某一类型突变或者以其高通量筛选技术高效快 速大量获得定向细胞突变体，由此产生定向同质突变体库。
[0007] 长期以来大部分植株再生都不是依赖于细胞水平上的再生，而是局限于个体或 器官组织水平的再生，由多细胞组织器官诱变产生的再生植株后代，因其个体众多细胞基 因突变的差异性往往导致突变体嵌合现象很严重，性状不稳定、重复性差、再生筛选时间延 长，同质突变体频率很低、由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊 端。
[0008] 如何使一个单细胞发育成一棵完整植株，一直是许多植物组培再生的难题。目前 的研究表明绝大多数植物体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚胎发生途径重演了合子胚形态 发生的过程，所以体细胞胚是高效再生种子来源、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转 化的理想的受体系统。
[0009] 研究表明：体细胞诱变、体细胞定向筛选及体细胞胚再生是高效快速定向获得同 质突变体、避免嵌合体形成的理想方法，很容易在短时间内获得大量的某一类型多性状的 同质突变体，产生表型可见并且遗传稳定的突变体库。所以体细胞理化诱变技术结合体细 胞突变筛选技术及体细胞胚再生技术，不但是保证高效快速获得饱和同质突变体库的关键 技术，还是保证高效快速定向获得同质突变体库的关键技术。
[0010]目前国内外尚未发现利用沿阶草体细胞通过r射线和EMS复合诱变再通过体细胞 胚直接再生植株或通过沿阶草体细胞r射线和EMS复合诱变后再紧接着进行体细胞定向筛 选，之后再通过体细胞胚直接再生植株，以其构建具有丰富变异材料的饱和高抗同质突变 体库的方法报道。因此本发明突破了以往：1)只以物理或化学等一种诱变方法创建突变体 库；2)以器官发生再生植株而导致突变体嵌合现象非常严重；对嵌合突变体进行筛选，不 仅延长筛选时间有时甚至是无意义的筛选，很难通过定向筛选快速获得同质突变体；3)由 于突变体嵌合现象很严重，导致后代性状不稳定、重复性差、突变体筛选鉴定时间延长，同 质突变体频率很低。所以以往方法很难快速获得遗传稳定的变异丰富的及定向突变的同质 突变体，也就难以高效快速地构建起遗传稳定的饱和定向同质突变体库。此项发明不但有 利于沿阶草功能基因组学、分子生物学机理、遗传育种与药理机制等方面的研究，还是沿阶 草抗逆遗传学、抗逆基因克隆非常重要的材料，具有重要的理论意义与使用价值。
【发明内容】
[0011] 发明目的：针对现有技术的不足，本发明主要解决的技术问题是提供一种沿阶草 体细胞r射线和EMS复合诱变后直接通过体细胞胚再生植株，及体细胞经r射线和EMS复 合诱变后再通过体细胞耐冷性定向筛选，之后通过体细胞胚再生植株的一种复合技术的优 化组合，通过其高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的一种优化方法。
[0012] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效快速构建沿阶草饱和 高抗同质突变体库的优化方法，该方法包括如下步骤：
[0013] 1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼 嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部〇. 5-1. Ocm大小外 植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再 生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；
[0014] 2)早期体细胞胚外植体的培养：切取上述具高频体细胞胚再生能力的外植体的 叶、茎基部0. 5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上培养7-10d，此时大部分体细胞 为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；
[0015] 3) γ射线和EMS理化诱变剂准备：包括6°C〇- γ射线源准备及辐射剂量的设置和 不同浓度甲基磺酸乙酯（EMS)溶液准备；6°C〇-y射线源：由江苏里下河地区农业科学研 究所提供；EMS溶液准备：配制0.0 lmol/L、pH5. 8的磷酸缓冲液并将诱导剂甲基磺酸乙酯 (EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得EMS溶液。其中所述0.0 lmol/L、pH5. 8的磷酸缓冲液和 EMS溶液的配制方法是：将lmol/L的Na2HP04溶液定为A液，将lmol/L的NaH2P04溶液定 为B液，分别取A液9. 21mL和B液0. 79mL，加入到量筒中，定容至1L，高压灭菌后冷却至室 温。在无菌条件下用一次性注射器吸取EMS经0. 22um的微孔过滤器注射到磷酸缓冲液中， 制成从0.0、0.3%、0.6%3个不同浓度的EMS溶液；
[0016] 4)早期体细胞胚外植体的γ射线和HMS复合处理：将早期体细胞胚外植体先分 成6个大组用于6个不同剂量γ射线处理，每个大组待γ射线处理结束后，再分成3份用 于3个不同浓度EMS诱变剂的处理；其中6°C〇-y射线处理：将已准备好的用于6°C〇-y射 线处理的6个大组的外植体直接放在不同辐射剂量6°C〇- γ射线下照射，处理结束后，拿回 无菌室再进行EMS溶液处理：在无菌环境下将经γ射线处理的外植体再分成3份用于3个 不同浓度EMS诱变剂的处理。每份外植体浸泡于上述各浓度的EMS溶液中处理1. 5小时， 处理期间将含外植体的容器置于摇床上以60 ± 5rpm的转速轻摇，EMS溶液处理毕，倒掉EMS 溶液，用无菌水浸没外植体，轻摇冲洗5-6次直至去除外植体中残留的EMS，处理结束后