，重 新接种于体胚发生诱导培养基中进行下一步筛选培养。
[0017] 5)细胞突变体筛选处理：将上述经γ射线和EMS复合处理过的早期体细胞胚外 植体分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5-8°C低温无菌培养箱 中暗培养7-10d;通过低温逆境筛选，可以保证高效定向筛选到抗逆（冷）性较强的突变体 细胞。
[0018] 6)体细胞胚分化培养：将2大类早期体细胞胚外植体即经低温筛选处理和未经低 温筛选处理的均转移到温度为25-28°C无菌室暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细 胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体；常温暗培养可 保证快速获得同质饱和突变体库。
[0019] 7)同质突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0. 5cm大小 块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28°C光下培养50-60d，中间继代一 次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；
[0020] 8)成熟同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁増殖培养：取上述经低温筛选并经 快繁増殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成〇. 5cm大小块，分别编号接种于体细胞胚快繁 增殖培养基，放入5-8°C低温无菌培养箱中弱光下（500-8001x)培养25-30d后，再继代转入 25-28°C光下（1500-20001X)培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；
[0021] 9)成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚 状体及抗逆（冷）性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室 温度25-28°C光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；
[0022] 10)同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1. 5cm时，将各突变体株系 分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；成活率 可达100%。揭去培养瓶的封口膜，在室内炼苗1~2d，用镊子小心取出小苗，洗净根上附 着的培养基，移栽到装有轻型基质（泥炭：蛭石=1:1)的花盆中，放入温室温度为24°C~ 26°C，适当遮荫，或将小苗放到苗床下，自动间歇喷雾装置浇水。
[0023] 11)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外 林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的过程中进行突变体 筛选、种质遗传多样性鉴定，以此高效快速构建起沿阶草理化诱变饱和高抗同质突变体库。 用于后续沿阶草遗传育种、生理药理机制分析和基因功能组学等方面的研究。由于小苗生 长旺盛，对移栽大田的条件要求也不高，极易种植，小苗的成活率可达100%。
[0024] 其中，辐射剂量和EMS溶液浓度：辐射剂量设置为0.0、5Gy IOGy 15Gy 20Gy 25Gy6个不同处理；EMS溶液配制成0. 0、0. 3%和0. 6% 3个不同浓度。
[0025] 其中，所述6°C〇- γ射线辐射剂量为15Gy ;EMS浓度为0. 3 %，EMS溶液浸泡处理时 间1. 5小时。
[0026] 其中，所述无菌培养基培养为 1/2MS+2. Omg/L ΒΑ+0. 5mg/L NAA+20g/L蔗糖+0· 7% 琼脂。
[0027] 其中，所述诱导培养基为13+0.211^/184+0.511^/1熟4+0.511^/12,4-二氯苯氧乙 酸 +30g/L 鹿糖 +3. 5g/L phytagel。
[0028] 其中，所述步骤1)高频体胚再生系统的培养：是指将初生胚状体转入高频体细胞 胚培养基上光下培养50-60d，光照强度为1500-20001x，光照时间为每天10-14小时，中间 继代一次，就会持续不断大量地产生次生胚状体即体细胞胚。
[0029] 其中，所述高频体细胞胚培养基为MS+2mg/L ΒΑ+0. 5mg/L NAA+40g/L蔗糖+3. 5g/ L phytagel〇
[0030] 其中，所述步骤7)中体细胞胚快繁增殖培养基为MS+2mg/L BA+0. 2mg/L NAA+40g/ L蔗糖+3. 5g/L phytagel，光照强度为1500-20001x，光照时间为每天10-14小时。
[0031] 其中，所述步骤9)中植株再生培养基为l/2MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂。
[0032] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS)和6°C〇-y射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可 在一个基因组上产生多个点突变，产生的突变可随机分布于整个基因组，且分布均匀，密度 高，成本低，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体 库；而r射线诱变主要是引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功 能缺失的突变体库的创建；所以这两种方法同时使用，通过优势互补，既可以增加突变体库 的容量，又能满足饱和突变体库的要求，更加丰富了饱和突变体库的内容，而且所获得的突 变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。对诱变细胞利用选择压力进行筛选可实 现定向诱变，也可以定向诱导基因组某一类型特定突变或者以其高通量筛选技术高效快速 大量获得定向地细胞突变体。体细胞诱变结合体细胞筛选及体细胞胚再生可实现短时间内 获得大量多种多样的定向同质突变体，容易产生表型可见并且遗传稳定的高抗同质突变体 库。通常突变体因其起源于多细胞，由于不同细胞突变基因的差异性，往往容易导致突变体 嵌合现象特别严重，后代性状很难稳定，导致重复性差，影响突变体再生性、延长了突变体 筛选时间，使得获得同质突变体频率很低，由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下 降等一系列弊端。所以此项发明不但在短时间内高效快速构建了饱和高抗沿阶草同质突变 体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、抗性遗传育种与生理药理发育等问题系统深 入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论 意义和应用价值。
【附图说明】
[0033] 图1细叶沿阶草；矮生沿阶草和黑沿阶草；
[0034] 图2胚性单细胞（左：细叶沿阶草；右：矮生沿阶草）；
[0035] 图3鱼雷胚、子叶胚和同质突变体（左：细叶沿阶草；右：黑沿阶草）；
[0036] 图4高抗同质突变体（黑沿阶草）；
[0037] 图5高抗同质突变体（细叶沿阶草）；
[0038] 图6盆栽沿阶草饱和高抗同质突变体库；
[0039] 图7 AAG/CT C引物组合在30份沿阶草种质中扩增的AFLP指纹；
[0040] 图8根据AFLP遗传相似系数计算的30份沿阶草种质的聚类图。
【具体实施方式】
[0041] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0042] 实施例1以细叶沿阶草高效快速饱和高抗同质突变体库构建的优化方法为例进 行说明。步骤是：
[0043] 1)高频体细胞胚外植体材料准备和早期体细胞胚外植体的培养：选取健康无 病虫害的细叶沿阶草植株（图1 :细叶沿阶草；矮生沿阶草和黑沿阶草），剥去老叶，取其 幼嫩茎基并带3-4片幼叶，无菌消毒后放入无菌培养基培养（1/2MS+2. Omg/L BA+0. 5mg/ L NAA+蔗糖20g/L+0. 7%琼脂）50-60d，中间继代一次，组培成试管苗，取其试管苗叶、茎 基部0. 5-1. Ocm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基（MS+BA (0. 2mg/L) +NAA (0. 5mg/ L) +2. 4D (0· 5mg/L) + 蔗糖 30g/L+3. 5g/L phytagel)上培养 50-56d，中间继代一次，将产生 的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基（MS+BA 2mg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖40g/L+3. 5g/L phytagel)上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生各个发育时期的 体细胞胚（球形胚、鱼雷胚）和胚状体，将胚状体转入无激素的成苗培养基（MS+白糖30g/ L+0. 7%琼脂）培养，20-25天后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源。切取 其叶、茎基部0. 5cm大小组织块作为高频体细胞胚外植体材料，放在体胚发生诱导培养基 上培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚（图2 :胚性单细胞左： 细叶沿阶草）在体胚发生的早期作为诱变剂处理材料。
[0044] 2) 6°C〇- γ射线诱变剂准备和EMS溶液准备：6°C〇- γ射线诱变剂准备：6°C〇- γ射 线源由江苏里下河地区农业科学研究所提